刘 民，徐枢雅

(扬州市公安局刑警察支队,扬州225009)

鱼塘投毒造成大量鱼虾死亡的案例每年都有发生,由于鱼塘水体积较大,水中毒药含量极低,要想取得较可靠的结果,必须对大量鱼塘水进行前处理。传统液液提取法或固相萃取小柱法不仅操作烦琐、耗时,还得不到满意结果,在此类案件中常束手无策。

本工作以辛烷基硅烷键合硅胶(C8)、十八烷基硅烷键合硅胶(C18)、聚二乙烯苯多孔小球GDX403[1]、大孔吸附树脂 X-5 等4 种填料混合而成的固相萃取吸附剂对常见的21 种农药进行富集[2-4],然后采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)进行测定。本工作采用的前处理方法(新型吸附剂-固相萃取)简洁、方便,具有一定创新性,可为实验室对大体积水样的前处理提供技术指南。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

AB Qtrap 4000型质谱仪、岛津LC-30AD 型超高效液相色谱仪;Turbo VapⅡ型自动氮吹浓缩仪;HY-2 型振荡器;Vortex-Genie 2 型漩涡混合器;MILLIPAK 型 纯 水 仪 ;Maximum Vacuum 型 真空泵。

21种农药标准储备溶液:分别吸取21种农药标准品各适量,或用甲醇稀释,配制成1．0 g·L－121种农药标准储备溶液。

21种农药混合标准溶液:取上述21种农药标准储备溶液各100μL 至10 m L 容量瓶中,用甲醇定容,配制成10 mg·L－1混合标准溶液。试验中所用其余质量浓度的混合标准溶液均从上述混合标准溶液用甲醇稀释而得。

内标物标准储备溶液:称取普罗迪芬盐酸盐(SKF525A)和苯巴比妥适量,用甲醇配制成两种质量浓度均为1．0 g·L－1的内标物标准储备溶液待用。

内标物混合标准溶液:分别取50μL SKF525A标准储备溶液和200μL 苯巴比妥标准储备溶液至100 m L容量瓶中,用甲醇定溶,配制成含SKF525A 0．5 mg·L－1和苯巴比妥2 mg·L－1的内标物混合标准溶液。

硫丹Ⅱ、氯硝柳胺、硫丹硫酸酯、鱼藤酮、甲氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯等21种标准品均为1．0 g·L－1或2．0 g·L－1的标准品溶液;内标物SKF525A 的纯度为95%,内标物苯巴比妥的纯度为98%。

乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯;乙酸铵为分析纯;C8(58～75μm)、C18(58～75μm)、聚二乙烯苯多孔小球GDX-403(150～180μm)、大孔吸附树脂X-5(1．08～2．00 mm,含水量65%～75%);试验用水为超纯水。

1．2 仪器工作条件

1．2．1 色谱条件

InertSustain C18色谱柱(2．1 mm×50 mm,2μm);柱温35℃;流量400μL·min－1;进样量5μL。

1)洗脱条件1 流动相:A 为含0．1%(体积分数,下同)甲酸的20 mmol·L－1乙酸铵溶液,B为乙腈。梯度洗脱程序:初始流动相B 为10%,保持1 min;2～10 min 时,B 由10%升至70%;10～11 min时,B 由70%升至90%,保持2 min;13～14 min时,B由90%降至10%,保持2 min。

2)洗脱条件2 流动相:A 为含0．1%甲酸的20 mmol·L－1乙酸铵溶液,B为甲醇。梯度洗脱程序:初始流动相B 为90%,保持1 min;1～2 min时,B由90%升至96%,保持2 min;4～5 min时,B由96%降至90%,保持2 min。

3)洗脱条件3 流动相:A 为20 mmol·L－1乙酸铵溶液,B为甲醇。梯度洗脱程序:初始流动相B为50%,保持2 min;2～3 min时,B由50%升至95%,保持2 min;5～6 min 时,B 由 95%降至50%,保持1 min。

1．2．2 质谱条件

电喷雾离子源(ESI),正离子和负离子模式,多反应监测(MRM)模式,雾化气和脱溶剂气为氮气,碰撞气为氮气,气帘气压力172．5 k Pa;离子喷射电压5 500 V(－4 500 V);雾化气温度500℃;雾化气压力345．0 k Pa,辅助加热气压力345．0 k Pa;入口电压10 V(－10 V),碰撞气出口电压15 V(－15 V)。对其余质谱参数进行优化[5],见表1。

表1 21种常见农药及2种内标物的质谱参数Tab．1 MS parameters of the 21 common pesticides and the 2 internal standards

表1(续)

1．3 试验方法

取鱼塘水样4 L于5 000 m L烧瓶内,添加内标物混合标准溶液100μL;称取由C8、C18、GDX403和X-5按1∶2∶1∶8的质量比混合而成的吸附剂6 g,经10 m L 甲醇浸泡活化、过滤后,加入到上述水样中;将烧瓶固定在振荡器上振荡约1 h,用布氏漏斗抽滤,将收集到的固相吸附剂连同滤纸一起放入250 m L锥形瓶中,加入5 g无水硫酸镁和苯、乙酸乙酯各100 m L,振荡10 min后,用1．0μm 微孔有机滤膜过滤,将滤液吹氮至近干,加入1 m L甲醇定容、0．22μm 微孔有机滤膜过滤,滤液按仪器工作条件进行测定[6]。

2 结果与讨论

2．1 色谱条件的选择

试验发现,流动相梯度变化大,以乙腈作流动相B,按洗脱条件1进行洗脱时,可分离的农药种类较多,适用鱼藤酮等6种目标物的测定;但按洗脱条件1进行洗脱时,甲氰菊酯等12种拟除虫菊酯类农药分离效果差甚至不出峰;而使用色谱条件2测定时,拟除虫菊酯类农药灵敏度高、峰形好,说明含0．1%甲酸的20 mmol·L－1乙酸铵溶液-甲醇的出峰效果优于含0．1%甲酸的20 mmol·L－1乙酸铵溶液-乙腈流动相[7],试验还发现,梯度洗脱时,初始流动相中甲醇含量要高[8],否则拟除虫菊酯类农药不出峰。洗脱条件3的流动相B为50%～95%,有效地避免了目标物出峰时间过早或过迟,适用于硫丹Ⅱ等3种农药的测定。因此,试验选择了3种洗脱条件,色谱图见图1。

2．2 质谱条件的选择

硫丹为实际鱼塘投毒案件中最常见毒物之一,前期大量UPLC-MS/MS试验结果表明[9],硫丹Ⅰ和硫丹Ⅱ的定量离子对和定性离子对、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)和保留时间均相同,虽然同含量硫丹Ⅰ和硫丹Ⅱ的相同定量离子对或相同定性离子对的峰强度有差异,但硫丹Ⅰ的定性离子对/定量离子对和硫丹Ⅱ的定性离子对/定量离子对的丰度比一致,硫丹Ⅱ的定性离子对或定量离子对峰强度更高。综合考虑,试验选择硫丹Ⅱ作为分析对象。

21种常见农药中,硫丹Ⅱ等3种农药因在电离时更容易失去质子,需采用负离子模式进行测定。内标物苯巴比妥也选择负离子模式。

因拟除虫菊酯类农药测定难度较大,本试验采用针泵注射方式,对12种拟除虫菊酯类农药在正离子和负离子模式下进行一级全扫描,发现溴氰菊酯等7种拟除虫菊酯类农药在正离子模式下的分子离子峰丰度最大。因此,这7种物质的母离子选择了],剩下5种拟除虫菊酯类农药和其他6种农药及内标物SKF525A 的母离子均选择了[M＋H＋]。

2．3 固相萃取剂的选择

图1 21种常见农药的色谱图Fig．1 Chromatograms of the 21 common pesticides

本工作采用由4种常见填料相混的混合物进行试验[10-12],C8、C18、GDX403 和 X-5 按1∶2∶1∶8的质量比混合。分别称取C8、C18、GDX403各2 g,X-5、混合填料各6 g,考察了 C8、C18、GDX403、X-5和混合填料等5种填料对19种目标物的提取效果,具体方法为:取空白水样4 L 共10份,各添加混合标准溶液200μL,得到水样中19种目标物的质量浓度均为0．5μg·L－1,再加入内标物混合标准溶液100μL;然后分别加入5种填料,每种填料有两个平行样,按试验方法进行测定,19种目标物定量离子对峰面积为A1。另取空白水样4 L 共10份,不添加混合标准样品,分别加5种填料,每种填料有两个平行样,在滤液吹氮缩至近干后,加1 m L含100μL混合标准溶液及100μL 内标物混合标准溶液的甲醇溶液定容,在仪器工作条件下测定,19种目标物定量离子对峰面积为A2。每次操作前,均取相应固相填料加入空白水样(4 L)进行空白比对,确保无干扰、无残留。回收率为A1/A2,如果2个平行样回收率的相对差值在5%之内,说明测定结果有效,取2次结果的平均值;否则,应重新测定。结果见表2。

表2 使用5种不同固相填料作为吸附剂时19种常见农药的回收率Tab．2 Recovery of 21 common pesticides with 5 different fillers as adsorbents %

由表2 可知:当使用单一填料进行提取时,19种常见农药的回收率有高有低;当使用混合填料进行提取时,19种常见农药的回收率与其他4种单一填料中回收率最高的相接近。因鱼塘投毒案件中毒物种类的不确定性,在检验中使用单一填料进行前处理,往往出现一种或多种目标物回收率极低甚至无法检出等情况,不能满足实际要求。

2．4 工作曲线

取空白水样4 L,添加混合标准溶液,配制成质量浓 度 为 0．5,0．25,0．1,0．05,0．025,0．01,0．005μg·L－1混合标准溶液系列,按试验方法进行测定。

21种目标物定量离子对峰面积为A3、内标定量离子对峰面积为A4,每次试验均用混合填料对空白水样进行空白比对,确保无干扰、无残留。以21种常见农药的质量浓度为横坐标,其对应的A3/A4结果为纵坐标绘制工作曲线,线性范围、线性回归方程及相关系数见表3。

表3 线性范围、线性回归方程和相关系数Tab．3 Linear ranges，linear regression equations and correlation coefficients

2．5 检出限

取6份空白水样(4 L),其中3份分别添加不同量的混合标准溶液,配制成含21种目标物质量浓度为0．001,0．002,0．005μg·L－1待测液,另3份空白水样作空白比对,按试验方法进行测定,按3倍信噪比计算检出限(3S/N),结果见表4,同时和气相色谱-质谱法(GC-MS)所得的检出限作比对,结果见表4。

表4 GC-MS和UPLC-MS/MS对21种农药的检出限Tab．4 Detection limits of 21 common pesticides found by GC-MS and UPLC-MS/MS

由表4 结果表明:新型吸附型-固相萃取-UPLC-MS/MS 测定水中21 种农药检出限为1～5 ng·L－1,远低于GC-MS的检出限。实际鱼塘投毒案件中的毒物检验,因目标物的不确定性,液相色谱-质谱法与气相色谱-质谱法各具优势[13],建议二种方法同时使用。

2．6 精密度和准确度试验

按试验方法对空白水样(4 L)进行加标回收试验,分别添加低、中、高等3个浓度水平的混合标准溶液,配制成质量浓度分别为0．025,0．05,0．5μg·L－1的混合标准溶液各6份。以测定值的相对标准偏差(RSD)考察日内精密度;以连续测定5 d的结果的RSD 考察日间精密度,以加标的每种目标物测得的质量浓度的平均值与此目标物的理论质量浓度的百分比考察方法的准确度[14-15],精密度和准确度试验结果见表5。

表5 21种农药的精密度和准确度试验结果(n＝6)Tab．5 Results of tests for precision and accurary of the 21 common pesticides(n＝6)

由表5 可知:21 种常见农药的日内RSD 为1．3%～9．7%,日间 RSD 为2．5%～13%,准确度试验结果为92．5%～106%。

2．7 样品分析

2018年12月,扬州某地区发生一起鱼塘内鱼大量死亡的案件,用本方法从送检的鱼塘水中检出了农药氯硝柳胺成分。经查,本案件系事主误将主成分为氯硝柳胺清塘剂投入鱼塘中所致。

2019年2月,某公安分局接到一起鱼塘疑似投毒案件,用本方法从送检的鱼塘水中检出了农药氯氰菊酯成分,其质量浓度为0．44μg·L－1,经查,本案件是由嫌疑人投放农药氯氰菊酯所致,检测出鱼塘水中氯氰菊酯的含量与根据嫌疑人交代的投放氯氰菊酯的量和鱼塘面积估计出的基本一致。

本工作采用的前处理方法新型吸附剂-固相萃取具有一定创新性,但实际应用中还有许多待改进之处,如不借助任何仪器设备就能快速地将固相填料从大体积水中分离出来,这将是固相萃取-填料荟萃法得到广泛应用的关键。