金 权，马红彦，胡 飞，王世革，刘 璐，黄明贤

(上海理工大学 理学院 化学系,上海200093)

介孔二氧化硅纳米球(MSNs)具有许多独特的性能,如良好的化学和热稳定性、高的比表面积、较大的孔体积、较窄的孔径分布(2～10 nm)、良好的生物相容性和易于表面修饰等[1]。这些特性使MSNs在生物检测和生物医疗领域的应用中倍受青睐[2]。MSNs最典型的合成方法是十六烷基三甲基溴化铵(CTAB,一种阳离子表面活性剂)胶束模板法[3-9];与CTAB 单模板法相比,双模板法(双表面活性剂法)可以扩大MSNs孔径[7-10],有利于孔内物质装填量的增加、负载量的提高及后续的纳米球表面修饰工作的进行。黄明贤课题组选用了CTAB和Capstone FS-66(一种短链碳氟阴离子表面活性剂)在弱碱性条件下合成了大孔径树枝状介孔硅胶纳米球[11],这种介孔硅胶纳米球的孔径、粒径和均匀性均可通过试验参数进行调节。

MSNs可作为制备荧光纳米颗粒的基质[12-14]。稀土铕配合物具有发光强度高、半峰宽窄、色彩纯度高等优点,已成为一种理想的发光材料[15]。在众多Eu3＋配合物中,Eu(DBM)3phen荧光强度和红光纯度均很高,将其掺杂到MSNs中,不仅可以改善稀土配合物的荧光发光性能,还能显著增加其化学稳定性[15-17]。和激光染料相比,稀土Eu3＋配合物Eu(DBM)3phen在MSNs中虽然不会表现出荧光消退现象[18],但由于两者是通过物理吸附作用进行连接的,易出现Eu(DBM)3phen从MSNs孔道泄漏的现象,限制了其应用。MALBA 等[19]考察了在MSNs 表面修饰不同硅烷偶联剂时对[Eu(DBM)3phen]荧光性能的影响,结果表明Eu(DBM)3phen/SiO2复合微球表面在经过硅烷试剂[如:(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷(APTES)]修饰后,其荧光强度得到了提高。吴大辉等[20]在Eu(DBM)3Phen/SiO2表面包覆了一层厚约10 nm的γ-甲基丙烯酰氧基三甲基硅烷(KH570),通过形成的核-壳结构解决了Eu(DBM)3Phen 泄漏的问题。本工作在吴大辉等[20]的研究基础上,首先利用双模板法制备了表面含氯丙基的大孔径树枝状介孔硅胶纳米球,然后采用聚乙烯亚胺(PEI)对其孔道表面进行键合来提高其对Eu(DBM)3phen的吸附作用。然后,用PEI和聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠 盐 (PSSMA)等 2 种 聚 电 解 质 在Eu(DBM)3Phen/SiO2-Cl-PEI纳米球表面进行层层自组装(LBL),并在其表面包覆一层二氧化硅。最后,为了让包覆后的纳米球能够与抗体或DNA 等分子连接,又对纳米球的表面进行了修饰,使其表面富含氨基。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

JEM 2011型透射电子显微镜(TEM);Philips XL30型扫描电子显微镜(SEM);Nicolet is5 型傅里叶变换红外光谱仪(FITR);Nano Brook 90plus Zeta型激光粒径仪;F-7000型荧光分光光度计;U-3900型紫外-可见分光光度计;NUAIRE-C200V-E型高速台式离心机;DHG-9030A 型电热鼓风干燥箱;IKA MS-3型数显型圆周振荡器;Cascada I型超纯水机;ME 204E/02型电子天平;DQ-300DE 型超声波清洗器;DF-101S型磁力搅拌器;DZF-6055型真空干燥箱;IKA RV 8 V-C型旋转蒸发仪。

聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为优级纯;四乙氧基硅烷(TEOS)、三乙醇胺(TEA)、二氯甲烷、无水乙醇、氨水、异丙醇、丙酮、乙二醇、甲苯、CTAB、氢氧化钠、Capstone FS-66均为分析纯;乙烯基三乙氧基硅烷、硝酸铵均为化学纯,γ-氯丙基三乙氧基硅烷纯度为98%,苯基三乙氧基硅烷纯度为99%,二苯甲酰甲烷(DBM)纯度为99%;氯化铕六水合物(EuCl3·6H2O)纯度为99．0%,1,10-邻菲啰啉盐酸盐纯度为98%,PEI纯度为99%,PSSMA(4-苯乙烯磺酸和马来酸的物质的量之比为3∶1),γ-氨丙基三乙氧基硅烷纯度为99%。试验用水为超纯水。

1．2 试验方法

1．2．1 MSNs的制备

根据对文献[11]报道的双模板法稍做改动的方法合成 MSNs。将1．92 g CTAB、0．35 m L TEA、0．32 g Capstone FS-66、100 m L 水 混 合 置 于250 m L的锥形瓶中,混合后超声15 min,置于磁力搅拌器上,在60 ℃下搅拌反应1 h。将15 m L TEOS和15 m L 无水乙醇的混合溶液加入上述250 m L锥形瓶中,在该温度下继续搅拌反应5 h。然后以10 000 r·min－1的转速离心5 min,将得到的沉淀物分别用无水乙醇洗涤2遍、丙酮洗涤1遍,然后用饱和的硝酸铵乙醇溶液淹没沉淀,在60℃下磁力搅拌5 h或者在550℃空气氛围中煅烧5 h,除去表面活性剂,最后置于鼓风干燥箱中,在80 ℃下干燥过夜。

1．2．2 含氯官能团的MSNs的制备

将1．92 g CTAB、0．35 m L TEA、0．32 g Capstone FS-66、100 m L 水置于250 m L 锥形瓶中,混合溶解,混合后超声15 min,置于磁力搅拌器上,在60 ℃下搅拌反应1 h。将13．5 m L TEOS、1．5 m L含有γ-氯丙基的硅烷偶联剂和15 m L 无水乙醇的混合溶液加入250 m L 锥形瓶中,在该温度下继续搅拌反应5 h。然后以10 000 r·min－1的转速离心5 min,将得到的沉淀物用无水乙醇洗涤2遍、丙酮洗涤1遍,然后用饱和的硝酸铵乙醇溶液淹没沉淀,在60℃下磁力搅拌5 h,除去表面活性剂,最后置于鼓风干燥箱中,在80 ℃下干燥过夜。含乙烯基、3-氨基丙基、苯基、三乙氧基官能团的MSNs的制备方法同上。

1．2．3 荧光配合物的制备

将1 mmol的EuCl3·6 H2O 溶于20 m L 无水乙醇中形成溶液A。取3 mmol的二苯甲酰甲烷和1 mmol的1,10-邻菲啰啉盐酸盐溶于50 m L 无水乙醇中形成澄清溶液B,置于250 m L 的锥形瓶中。将A 逐滴加入B 中形成混合溶液后,置于60 ℃的水浴锅中进行磁力搅拌反应。搅拌反应的同时,用饱和氢氧化钠乙醇溶液调节混合溶液的酸度至p H 7,当出现大量的黄色沉淀时,停止搅拌,以10 000 r·min－1的转速离心5 min,将得到的沉淀物用体积比为3∶1的乙醇-水溶液洗涤多次后,置于真空干燥箱中,80 ℃ 干燥过夜,得到Eu(DBM)3phen。

1．2．4 表面修饰不同功能团修饰的MSNs对荧光配合物的吸附制备

首先将0．02 g Eu(DBM)3phen、10 m L 的二氯甲烷置于50 m L 的试管中,超声15 min形成透明溶液。然后将0．2 g含不同功能团的MSNs分别加入上述溶液中,使形成的混合溶液中Eu(DBM)3phen的质量分数是含不同功能团的MSNs的10%。室温下振荡反应6 h,以10 000 r·min－1的转速离心5 min,得到的沉淀物分别用无水乙醇和丙酮洗涤2遍,置于真空干燥箱中,在50 ℃下干燥10 h。

1．2．5 含氯功能团的MSNs表面嫁接PEI

将表面修饰有含氯功能团的MSNs 0．2 g溶于30 m L 的异丙醇溶液中,并向溶液中加入0．06 g PEI,使混合溶液的PEI的质量分数约为含表面修饰有含氯功能团的 MSNs 的30%。混合超声10 min,并在室温下振荡反应24 h,以10 000 r·min－1的转速离心5 min,将得到的沉淀物分别用异丙醇洗涤1次、无水乙醇洗涤2次,最后置于鼓风干燥箱中,在50 ℃干燥过夜,得到Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl-PEI。

1．2．6 聚电解质的层层自组装吸附

将0．1 g Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl-PEI、质量分数为0．5%的 PSSMA 溶液10 m L、10 m L 的水混合,超声5 min混匀后振荡反应1 h。以10 000 r·min－1的转速离心5 min,在5 ℃下将得到的沉淀物用0．05 mol·L－1的氯化钠溶液分散洗涤2次,以去除未参与反应的聚电解质。在洗涤好的固体中加入质量分数为0．5%的PEI溶液10 m L和10 m L的水溶解,超声5 min 混匀后,振荡反应1 h。以10 000 r·min－1的转速离心5 min,用0．05 mol·L－1氯化钠溶液洗涤2次,将洗涤好的固体按照上述方法,再依次使用质量分数为0．5%的PSSMA 溶液和质量分数为0．5%的PEI溶液按照以上方法再包覆2次。

1．2．7 二氧化硅包覆

将已层层自组装的含铕配合物的MSNs 0．2 g分散于10 m L水中,加入质量分数为0．05%的PVP溶液 10 m L、1 m L 氨水、10 m L 乙 二醇、0．3 m L TEOS,振荡反应6 h。其中,TEOS需要分批加入,以0．05 m L·h－1的量加入反应体系中。反应完成后,以10 000 r·min－1的转速离心10 min,将得到的沉淀物用体积比为1∶1 的乙醇-水溶液洗涤2次,最后放入鼓风干燥箱,在60 ℃下干燥过夜。

1．2．8 表面氨基化修饰

将1．2．7 节中得到的0．50 g真空干 燥 好 的 固体、50 m L 的无水甲苯、0．3 m L 3-氨基丙基三乙氧基硅烷置于500 m L 的三颈烧瓶中,然后在120 ℃下加热回流反应8 h,反应完成后,将得到的悬浮液以10 000 r·min－1的转速离心10 min,沉淀物用甲苯和无水乙醇离心洗涤,然后放在真空干燥箱中,在60 ℃下干燥24 h。

荧光纳米球制备过程示意图见图1。

图1 荧光纳米球的制备示意图Fig．1 Schematic diagram of preparation of the fluorescent nanospheres

2 结果与讨论

2．1 MSNs的SEM 及 TEM 形貌

CTAB和Capstone FS-66 混合均匀形成胶束后,在TEA 弱碱性条件下,TEOS水解并缩聚形成大孔径树枝状MSNs,MSNs的SEM 图和TEM 图见图2。

图2 MSNs的SEM 图和 TEM 图Fig．2 SEM and TEM images of the MSNs

由图2 的SEM 和 TEM 图可以看出:合成的MSNs具有单分散性高、颗粒大小均匀、孔径较大等特点,纳米球粒径约为170 nm,比单模板法合成的MSNs的大。在使用典型的单模板法制备MSNs时,CTAB形成带正电的胶团模板,TEOS水解缩合得到带负电的硅胶低聚物,由于静电作用,两者发生相互作用,通过自组装效应,硅胶低聚物在CTAB胶团作用下缩聚成二氧化硅纳米粒子。当纳米球表面所带负电荷足以去抑制纳米粒子的进一步生长时即形成了稳定的纳米球形态。本试验选择了CTAB和Capstone FS-66双模板法。相对于其他表面活性剂,Capstone FS-66具有高化学稳定性、高表面活性、在较低含量下也能较大程度地降低水溶液的表面张力等优点,可改变CTAB 胶团模板的性质:一是在CTAB胶团模板中作为膨胀剂扩大了MSNs的孔径,有利于增加孔内物质装填、负载量的提高及后续的纳米球表面修饰工作的进行;二是在降低了CTAB胶团的表面张力同时,还可能减少水-CTAB胶团界面的曲率。CTAB 和Capstone FS-66 双模板系统热力学系统更稳定、分散性更好、与硅胶低聚物的作用比CTAB单模板系统更小,形成的MSNs单分散性更好、粒径和孔径更大。

2．2 表 面 修 饰 不 同 官 能 团 的 MSNs 对Eu(DBM)3 phen配合物的荧光性能的影响

对1．2．4节合成的含γ-氯丙基、苯基、乙烯基、3-氨基丙基的荧光纳米球[Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl、Eu(DBM)3phen/SiO2-C6H6、Eu(DBM)3phen/SiO2-C2H4、Eu(DBM)3phen/SiO2-NH2]及不用硅烷偶联剂修饰的荧光MSNs[Eu(DBM)3phen/SiO2]的荧光性能进行了考察,见图3。

图3 含不同官能团的纳米球的荧光发射光谱Fig．3 Fluorescence emission spectra of the nanospheres containing different functional groups

由图3的荧光发射光谱可看出:各物质均在波长613 nm 处有着强而尖的荧光发射峰,同时由于纳米球表面所含功能团不同,吸附荧光物质的能力也有着显著的差异,含氯官能团的MSNs吸附荧光配合物的效果最佳,其荧光强度约2 000 a．u。

2．3 Eu(DBM)3 phen/SiO2-Cl-PEI的表面电性能及荧光性能

PEI作为一种水溶性高分子聚合物,含有伯胺、仲胺和叔胺等功能基团,对金属离子具有很强的络合能力。通过在Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl表面嫁接 PEI,可 增 强 MSNs 对 荧 光 配 合 物Eu(DBM)3Phen的吸附能力。为考察PEI荧光增强的效果,对PEI修饰前后的纳米球进行了Zeta电位和荧光测试,结果见表1和图4。

表1 Eu(DBM)3 phen/SiO2-Cl与Eu(DBM)3 phen/SiO2-Cl-PEI的Zeta电位Tab．1 Zeta potential of Eu(DBM)3 phen/SiO2-Cl and Eu(DBM)3 phen/SiO2-Cl-PEI

由表1可以看出:Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl的Zeta电位为负值,在嫁接PEI后,Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl-PEI的Zeta电位变为正值,且数值明显增大,说明PEI成功嫁接在Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl表面。

由图4 可以看出:Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl-PEI荧光强度为4 120 a．u,远大于修饰前的Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl 的 荧 光 强 度 (约2 000 a．u),说明纳米球的孔道表面经PEI修饰后,对Eu(DBM)3phen吸附能力明显增强。

图4 Eu(DBM)3 phen/SiO2-Cl-PEI的荧光发射光谱Fig．4 Fluorescence emission spectrum of Eu(DBM)3 phen/SiO2-Cl-PEI

2．4 Eu(DBM)3 phen/SiO2-Cl-PEI包覆二氧化硅后的表面电性能、荧光性能和TEM 形貌

为了防止Eu(DBM)3phen从纳米球内泄漏出来,保持荧光纳米球的稳定性,还需要在荧光介孔二氧化硅纳米球(Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl-PEI)表面实施包覆。本试验先是采用2种聚电解质材料通过层层自组装技术对纳米球表面进行多层包覆,然后又在纳米球表面包覆了一层二氧化硅。因二氧化硅具有很好的稳定性且表面易被修饰,可继续在纳米球表面进行氨基化修饰,从而建立与抗体或DNA等分子的连接。为了考察纳米球的包覆效果,对其Zeta电位进行了考察,结果发现,包覆后纳米球的Zeta电位为－29．26 m V,迁移率为－2．29 V·cm－1,频率为230．24 Hz,频移为－20．00 cm－1,和SiO2包覆前的表面电性能相比,Zeta电位变为负值,说明二氧化硅成功包覆在Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl-PEI的表面,因为二氧化硅在p H＞7的溶液测试环境下表面显示电负性,此外,还对包覆后微球的荧光强度和TEM 形貌进行了考察,见图5和图6。

由图5可以看出:纳米球在经过多次包覆和洗涤后,荧光强度约为2 800 a．u,是包覆前的荧光强度(4 120 a．u)的68%,说明在其表面包覆二氧化硅后依然保持良好的荧光强度。

图5 二氧化硅包覆后微球的荧光发射光谱Fig．5 Fluorescence emission spectrum of the nanospheres after coating with silica

图6 SiO2 包覆后纳米球的TEM 图Fig．6 TEM image of nanospheres after coating with SiO2

由图6 可以看出:纳米球直径增大到约230 nm,MSNs的树枝状孔结构已完全被表面形成的SiO2层覆盖了,有利于解决荧光配合物的泄漏问题及继续在纳米球表面进行氨基化修饰,从而建立与抗体或DNA 等分子的连接。

2．5 氨基化修饰后纳米球的红外谱图

为了使二氧化硅包覆好的纳米球可以与抗体、DNA 等生物分子连接,需对其表面进行修饰,其中氨基化修饰是最常用的方法[21]。为了考察氨基修饰前后微球表面官能团的变化,进行了FTIR 测试,见图7。

图7 未修饰氨基(a)和已修饰氨基(b)的MSNs的红外光谱图Fig．7 FTIR spectra of the MSNs with unmodified amino groups and modified amino groups

由图7可知:1 082 cm－1处存在的强而宽的吸收峰属于 Si－ O －Si 的反对称伸缩振动;3 431 cm－1处的强而宽的吸收峰属于Si－O－H 的伸缩振动和O－H 的伸缩振动;1 639 cm－1处的吸收峰是H－O－H 的弯曲振动峰,953 cm－1处的吸收峰属于Si－OH 的振动吸收峰;790 cm－1的吸收峰是Si－O 的对称伸缩振动峰,由此可得出,微球表面的物质为二氧化硅。比较两条曲线,曲线(b)在1 543 cm－1处出现了新吸收峰,为氨基的弯曲振动峰,说明微球表面已经修饰上了氨基官能团。

本工作先用双模板法合成了树枝状MSNs,然后在其纳米球孔道内修饰了含氯功能团和PEI,修饰过的 MSNs 可以更有效地吸附荧光配合物Eu(DBM)3phen。为了增加荧光配合物纳米球的稳定性,在荧光介孔二氧化硅纳米球表面层层自组装包覆聚合物电解质后进一步包覆二氧化硅层。最后在其表面进行氨基化修饰,从而可以在下一步工作中使其与抗体分子连接,达到在荧光免疫分析中标记生物分子的目的。