王丹丹

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150227）

鸡传染性支气管炎（IB）是由冠状病毒属的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起鸡的一种高度接触性传染病，是严重影响我国养鸡业的主要疫病之一。为了防治IB，除了用严格的生物安全措施外，疫苗免疫接种已成为防治IB不可缺少的手段之一。IB常规疫苗分为弱毒疫苗和灭活疫苗，是养鸡生产中不可缺少的。IBV血清型众多，各血清型之间没有或仅有部分交叉免疫保护。研究表明，我国目前流行的IBV血清型主要属于马萨诸塞型（Massachusetts）[1]。M41株是马萨诸塞型的标准毒株，该毒株以繁殖滴度高、免疫原性好、特异性强等优点在世界范围内被广泛使用[2]。在进行IB 灭活疫苗研究时，选用M41作为IB灭活疫苗的种毒株。为此，研究对M41株进行了鉴定和传代研究，并建立M41株种子库。

1 材料与方法

1.1 病毒

IBV M41株购自中国兽药监察所。

1.2 IBV M41的HA抗原和阳性血清

IBV（M41 株）HA抗原购自荷兰GD 公司。抗血清由本实验室自制，小量分装，-70 ℃保存，HI≥1∶256。

1.3 SPF鸡和SPF鸡胚

SPF鸡和SPF鸡胚来自哈药集团生物疫苗有限公司SPF鸡场。

1.4 毒种的复壮和传代

将毒种作103倍稀释，接种10 日龄的SPF 鸡胚，每个胚尿囊腔接种0.1 mL。接种后将30 h前死亡的鸡胚剔除，收取30～48 h死胚和48 h活胚尿囊液，记为E0 代，低温保存备用。将M41 株毒种用SPF胚连续传12代，分别记作E1～E12。

1.5 病毒含量（EID50）

将E1、E5、E9和E12代次的毒种分别作10倍系列稀释，取10-4～10-85个稀释度，每个稀释度接种5个10日龄的SPF鸡胚，每胚接种0.1 mL。剔除24 h 前死亡的鸡胚，观察144 h，计算病毒的EID50。接种后24～144 h，鸡胚死亡或存活鸡胚的胎儿出现失水、蜷缩、发育矮小等特异症状判为感染。

1.6 毒力

1.6.1 对鸡胚毒力的测定

将E1、E5、E9 和E12 代次毒种用灭菌生理盐水作1 000 倍稀释，尿囊腔内接种10 日龄SPF 鸡胚10 个，每个0.1 mL，置37 ℃继续孵化，照胚1～2次·d-1，记录24～144 h内死亡胚的数量和胎儿病变情况。

1.6.2 对SPF鸡毒力的测定

将E1、E5、E9和E12代次的毒种分别作10倍稀释，经气管接种10只10日龄以内的SPF鸡，每只0.1 mL，观察10 d，记录鸡的临床症状，在攻毒后第10天，剖杀鸡，取气管，制气管环，在显微镜下观察环纤毛破坏情况，对个别气管环作病理切片。

1.7 特异性

将E1、E5、E9 和E12 代次毒种用灭菌PBS 稀释1 000 倍，分别与10 倍稀释的抗IBV、NDV、AIV和EDSV特异血清中和，在室温作用1 h，接种10 日龄SPF 鸡胚各10 枚，每胚0.2 mL，置37 ℃继续孵化，观察到144 h，记录24～144 h 内死亡胚的数量和胎儿病变情况，出现死亡或胎儿病变视为鸡胚感染IBV。

1.8 免疫原性

用甲醛灭活E1、E5、E9 和E12 代次病毒，并分别与油佐剂按1∶3比例乳化，制成灭活疫苗，接种4 周龄的SPF 鸡（2 周龄时滴鼻接种IBV H120 疫苗），免疫4周后测定血清的HI抗体。

1.9 IBV分离株对M41阳性血清的反应性

将9 株来自5 个不同地区的IBV 分离株尿囊液用灭菌PBS作1∶1 000稀释，与等量的10倍稀释的M41 株特异抗血清混合，室温作用1 h，然后每个毒株-血清混合物接种到10个鸡胚尿囊液中，每胚接种0.1 mL，同时设SPF血清作对照。接种后，每天照胚2 次，随时取出死亡的鸡胚，孵化144 h，取出全部鸡胚。对每个鸡胚收获尿囊液，用RT-PCR 方法检测尿囊液中是否含有IBV 病毒（具体方法见附录2）。RT-PCR结果阳性的鸡胚判为感染，统计鸡胚感染情况。

1.10 湿毒种保存期

将M41株E1、E5和E9代次的SPF鸡胚尿囊液毒分成数等份，分别存放于-70 ℃；病毒冻干后放-20 ℃冰箱内。在不同时间测定病毒的EID50，每次设3个重复。

2 试验结果

2.1 毒种的复壮和继代

M41 株冻干毒种在10 日龄SPF 鸡胚上复壮，收获的胚液计为E0 代毒，然后将E0 代次毒在10日龄的SPF 鸡胚继代12 次，得到E1～E12 代次毒，小量分装，-70 ℃保存备用。

2.2 病毒含量（EID50）

病毒含量（EID50）结果见表1。

表1 M41株各代次毒种EID50测定

由表1 可知，E1～E12 代次M41 株的易感鸡胚尿囊液的EID50为10-6.1·0.1 mL-1～10-6.3·0.1 mL-1，没有明显改变。

2.3 毒力

2.3.1 对鸡胚毒力

各代次毒种对鸡胚毒力的测定结果见表2。

由表2 可知，E1～E12 代次病毒在接种鸡胚后的24～144 h，可以致50%的鸡胚死亡。早期死亡的鸡胚胚体发红，有尿酸盐沉积；后期胚体矮小、蜷缩，多数有尿酸盐沉积，但随着传代代次的增加，对SPF鸡胚毒力有下降的趋势。说明各代次病毒对鸡胚具有一定的致病力，但致病力有下降的趋势。

2.3.2 对SPF鸡毒力

各代次毒种对SPF 鸡毒力的测定结果见表3，呼吸道症状见图1。

表2 各代次毒种对鸡胚毒力的测定

表3 各代次毒种对SPF鸡毒力的测定

图1 呼吸道症状

由表3 和图1 可知，给SPF 鸡接种不同代次的M41株后，只有少数SPF鸡出现程度不同的呼吸道症状；但气管环试验表明，接种不同代次M41 株病毒后，SPF 鸡的气管纤毛都受到程度相近的破坏，这表明，各代次的M41株病毒对SPF鸡具有一定的毒力，随着传代次数的增加（E1～E12），毒力没有发生明显的改变。

2.4 特异性

各代次毒种特异性的测定结果见表4。

由表4可知，各代次病毒能被IBV特异血清中和，表现为接种鸡胚后，100%鸡胚发育正常，说明没有被IBV感染；病毒不能被NDV、AIV（H9）和EDSV 特异血清中和，表现为接种鸡胚后100%的鸡胚发育矮小，说明被IBV感染。

表4 各代次毒种特异性的测定

2.5 免疫原性

不同代次的M41 株病毒免疫原性试验结果见表5。

由表5可知，各代次病毒制成的灭活疫苗免疫SPF 鸡后都能产生较高的HI 抗体，这表明各代次病毒仍然具有很好的免疫原性。

表5 不同代次的M41株病毒免疫原性试验

2.6 IBV分离株与抗M41阳性血清中和试验

IBV 分离株与M41 阳性血清中和试验结果见表6。由表6可知，M41株的特异阳性血清可全部或部分中和5个不同地区（河南省、山东省、河北省、黑龙江省、北京市）分离的9 株IBV 中的6 株（SD、HN1、HN2、HB1、HL1、HL2），表现为与相应阴性血清对照组比较，这6株病毒与M41特异阳性血清作用后，无鸡胚感染或感染IBV的鸡胚数量明显减少；而与对照血清作用的病毒株可使100%鸡胚感染。

表6 IBV分离株与M41阳性血清中和试验

2.7 保存期

M41株毒种保存期的测定结果见表7。

由表7 可知，各代次病毒湿毒存放在-70 ℃条件下，经过24 个月，病毒含量没有显著变化；冻干毒存放在-20 ℃条件下，经过42个月，病毒含量没有显著变化。

表7 M41株毒种保存期的测定

2.8 种子库

根据2.1～2.7的结果，将E0代次病毒传代至12代，M41 株毒种的特性没有发生明显的变化，因此，将M41 株E0 代次病毒作为原始种子，基础种子的代次范围定为E1～E5代，生产用毒种的代次控制在基础种子基础上传代不超过3代，即控制在E9代以内。分别建立了M41株病毒的原始种子库、基础种子库和生产种子库，以便进行M41株病毒灭活疫苗的研究和生产。

3 结 论

IBV的M41株具有免疫原性好、特异性强和繁殖滴度高等优点；经过继代，在E12代次以内，病毒的各种生物学特性没有明显的改变，说明该毒株生物特性稳定。各代次IBV M41 株湿毒在-70 ℃条件下保存24 个月和冻干毒在-20 ℃条件下保存36个月，病毒的效价没有明显的改变，可作为毒种进行灭活疫苗的研制。