刘 程，何韵秋，徐宁宁，叶均安

（浙江大学新农村发展研究院，浙江杭州310058）

泌乳中后期奶牛奶产量以每月6%～7% 的速度下降，减缓奶产量下降速度、提高泌乳持续力成为泌乳中后期奶牛饲养管理中的关键任务[1]。泌乳中后期奶牛奶产量下降受到生理和营养两方面因素的影响，因此通过提高日粮养分利用率来保证能量和蛋白供给成为维持泌乳中后期奶牛奶产量的重要途经[2]。反刍动物瘤胃是一个复杂的生态系统，包括细菌、真菌、原虫和少量噬菌体[3]。在瘤胃微生物中细菌种类最多、最复杂，与营养物质的消化和代谢密切相关[4]，因此分析瘤胃细菌结构和多样性变化对研究不同因素的作用机理有重要意义。研究发现，日粮添加益生菌能够显著提高纤维降解菌数量，进而提高干物质（DM）和中性洗涤纤维（NDF）降解率，提高生产性能[5-6]。由于不同菌属益生菌之间存在协同作用，研究热点已逐渐从添加单一益生菌向复合益生菌方向发展[7]。目前，研究多集中在探究复合益生菌对奶牛生产性能和瘤胃发酵的影响[8-9]，对于其作用机理的研究较少。本试验利用高通量测序技术对奶牛瘤胃菌群进行分析，探究复合益生菌如何通过影响瘤胃菌群结构来提高奶牛生产性能，为拓宽复合益生菌在反刍动物上的应用提供数据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料 复合益生菌购自杭州利牧源科技有限公司，含地衣芽孢杆菌（活菌数≥1.0×109CFU/g）、枯草芽孢杆菌（活菌数≥2.0×109CFU/g）和米曲霉（活菌数≥ 2.0×104CFU/g）。

1.2 试验设计 选取健康泌乳中后期荷斯坦奶牛20 头，按照奶产量（21.3±4.4）kg/d、泌乳天数（211±36.3）d和胎次（1.9±0.7）相近原则，随机分为2 组，每组10头奶牛。对照组饲喂全混合日粮（TMR），试验组在TMR 中每天每头牛添加复合益生菌20 g，预试期添加量减半。

1.3 饲养管理与日粮组成 饲养试验于2018 年7 月17日—8 月30 日在浙江省宁波市荷优牧业有限公司进行，试验期45 d，预试期7 d。奶牛采用栓系式饲养，自由采食和饮水。每天于06:00 和18:00 喂料，各组TMR饲喂量基本一致；试验组复合益生菌按早、晚各半拌入TMR 中。TMR 组成及营养成分见表1。

表1 TMR 组成及营养成分

1.4 测定指标

1.4.1 奶产量 试验开始前连续3 d 测定每头牛的奶产量记作初始奶产量，试验期每隔7 d 测定1 次奶产量。每隔15 d 采集早、晚乳样，按照50:50 比例混匀，装入50 mL 含有万分之六重铬酸钾的离心管，送上海市DHI 检测中心检测乳成分。4%乳脂矫正乳和能量校正乳计算公式如下：

4%乳脂校正乳（kg/d）=0.4×奶产量（kg/d）+15×乳脂率×奶产量（kg/d）

能量校正乳（kg/d）=奶产量（kg/d）×[（0.0929×乳脂率）+（0.0563×乳蛋白率）+（0.0395×乳糖率）]÷0.749

1.4.2 采食量 试验结束前3 d，连续记录投料量与剩料量，计算采食量。

1.4.3 表观消化率 对照组与试验组分别随机选取8 头试验牛，于饲养试验结束前3 d 直肠取粪，通过内源指示剂法测定营养物质表观消化率。计算公式：

饲料某养分消化率=100 － 100×（饲料中AIA 含量/ 粪中AIA 含量）×（粪中某养分含量/ 饲料中某养分含量）

式中，AIA 为酸不溶灰分。

1.4.4 瘤胃发酵参数 选择直肠取粪的试验牛，于试验结束当天口腔采集瘤胃液，立即测定pH，然后-20℃保存。通过气相色谱仪测定挥发性脂肪酸（VFA）含量，考马斯亮蓝法和比色法分别测定微生物蛋白（MCP）和氨态氮（NH3-N）浓度。另取50 mL 瘤胃液于-80℃保存，用于DNA 的提取和PCR 扩增。

DNA 的提取和PCR 扩增：采用CTAB 的方法[10]提取样品DNA，利用NanoDrop2000 进行DNA 浓度和纯度的检测。用无菌水将提取DNA 稀释至1 ng/μL，用V4 区引物 515F（5´-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3´）和 806R（5´-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3´） 进行 PCR 扩增。PCR 反应体系为 30 μL：Phusion Master Mix（2×）15 μL；引物（2 μmol/L）3 μL；DNA（1 ng/μL）10 μL；去离子水2 μL。PCR 反应程序：98℃预变性1 min；进行 30 个循环包括 98 ℃变性 10 s；50 ℃退火 30 s；72℃延伸30 s；最后72℃延伸5 min。PCR 产物用2%浓度琼脂糖凝胶电泳检测。使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建库试剂盒（Thermofisher）进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit 定量和文库检测合格后，使用IonS5TMXL（Thermofisher）进行上机测序，测序公司为北京诺和致源科技股份有限公司。

1.5 统计分析 使用 Cutadapt（V1.9.1）先对 reads 进行低质量部分剪切，再根据Barcode 从得到的reads 中拆分出各样品数据，截去Barcode 和引物序列初步质控得到原始数据，原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据。利用 Uparse 软件（Uparse v7.0.1001）以 97% 的一致性将序列聚类成为OTUs（Operational Taxonomic Units）。 用 Mothur 方 法 与 SILVA132（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA 数据库进行物种注释分析（设定阈值为0.8～1），获得分类学信息并分别在各个分类水平（界、门、纲、目、科、属、种）上统计各样本的群落组成。用Qiime 软件（Version 1.9.1）计算Chao1、ACE、Shannon、Simpson 指数，Unifrac 距离，使用R 软件（Version 2.15.3）绘制稀释曲线，WGCNA，stats 和 ggplot2 软件包进行 PCoA 分析。Anosim 分析使用R vegan 包anosim 函数，基于Bray-Curtis 距离值的秩次进行组间差异显著性检验。

奶产量、乳成分、表观消化率、发酵参数、α多样性等数据采用Excel 2013 进行整理，应用SAS 9.2 软件Proc mixed 模型进行方差分析，Tukey 进行多重比较分析，其中P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 复合益生菌对奶产量、乳成分和干物质采食量的影响 如图1 所示，2 组奶牛奶产量整体呈下降趋势，但试验组下降幅度显著低于对照组。方差分析结果显示（表2），试验组奶产量显著高于对照组，但是2 组间4%乳脂校正乳（4%FCM）、能量校正乳（ECM）和干物质采食量均无显著差异。由表3 可知，试验组的乳蛋白和总固形物产量显著高于对照组，其他指标无显著差异。

图1 泌乳中后期奶牛奶产量变化曲线

表2 复合益生菌对泌乳中后期奶牛干物质采食量、奶产量的影响 kg/d

2.2 复合益生菌对表观消化率的影响 由表4 可知，试验组粗蛋白质（CP）表观消化率显著高于对照组，而DM、粗脂肪（EE）、NDF 和酸性洗涤纤维（ADF）表观消化率在2 组间无差异。

2.3 复合益生菌对瘤胃发酵参数的影响 由表5 可知，试验组奶牛瘤胃MCP 浓度显著高于对照组，但是瘤胃pH、VFA 和NH3-N 浓度在2 组间无显著差异。

2.4 复合益生菌对瘤胃细菌菌落组成的影响

表3 复合益生菌对泌乳中后期奶牛乳成分的影响

表4 复合益生菌对泌乳中后期奶牛营养物质表观消化率的影响 %

表5 复合益生菌对泌乳中后期奶牛瘤胃发酵参数的影响

2.4.1 复合益生菌对瘤胃细菌丰富度和多样性的影响 过滤掉低质量碱基序列后2 组样本共得到1 373 913 条记录，过滤掉嵌合体后用于分析的优质序列共有1 288 680 条，序列平均长度为414.8。从图2 可以看出，在当前测序深度下，各样品基于OTU 水平的稀释曲线趋于平缓，说明本试验测序数量合理，能够进行后续分析。将序列以97% 的一致性进行OTUs 聚类，共得到2 286 个OTUs，其中2 组共有OTUs 共计1 939 个，占总OTUs数目的84.82%；差异OTUs 中对照组有192 个，试验组有155 个（图3）。由表6 可知，对照组和试验组Chao1 和ACE 指数无显著差异，说明复合益生菌对瘤胃细菌菌群的丰富度无显著影响；Shannon 和Simpson指数无显著差异，说明复合益生菌对瘤胃细菌菌群的多样性无显著影响。

图2 样品稀释曲线

图3 OTU 韦恩图

表6 复合益生菌对瘤胃细菌丰富度和多样性的影响

2.4.2 复合益生菌对瘤胃细菌组成和结构的影响 在门水平上（表7），复合益生菌对奶牛瘤胃细菌相对丰度无显著影响；但是在属水平上（表8），试验组的琥珀酸菌属相对丰度显著高于对照组，琥珀酸弧菌属显著低于对照组，瘤胃球菌属有升高的趋势（P=0.06）。

2.4.3 聚类分析通过Unweighted Unifrac 主成分分析可以看出（图4），2 组样品能较好地分开，PC1 解释28.36% 的差异，PC2 解释14.3% 的差异。但是聚类树分析不能将对照组和试验组有效区分（图5）。Anosim分析表明本试验中组间差异大于组内差异（R=0.12），但2 组间不存在显著差异。

表7 复合益生菌对瘤胃细菌相对丰度（门水平）的影响（top10） %

表8 复合益生菌对瘤胃细菌相对丰度（属水平）的影响（top10） %

3 讨 论

图4 PCoA 分析

图5 UPGMA 聚类树分析

3.1 复合益生菌对泌乳中后期奶牛泌乳性能的影响 益生菌能够通过提高瘤胃微生物活动促进日粮瘤胃降解，为泌乳提供充足的代谢能和代谢蛋白。夏天婵等[11]试验发现，添加由酵母培养物和芽孢杆菌等组成的复合益生菌能够使泌乳中后期奶牛奶产量提高5.3%，显著提高乳蛋白率、乳糖率和总固形物，且显著提高瘤胃中MCP 含量。本试验中，复合益生菌同样显著提高了泌乳中后期奶牛奶产量、乳蛋白和总固形物产量。Tricarico 等[8]研究表明，添加米曲霉提取物可显著提高泌乳中期奶牛乳脂校正乳和能量校正乳产量，乳蛋白产量也呈上升趋势。丁洪涛等[9]研究表明，枯草芽孢杆菌能促使瘤胃发酵类型向丙酸型转变，提高日粮利用率，促进瘤胃纤维降解。黄帅等[12]研究表明，米曲霉显著提高了日粮DM、CP、ADF 和NDF 的瘤胃降解率。本试验中奶产量提升可能是复合益生菌促进了瘤胃发酵，提高了饲料转化效率，为泌乳提供更多的能量和蛋白供给。乳蛋白产量提高可能与复合益生菌促进瘤胃微生物生成量，提高了代谢蛋白供给有关。

3.2 复合益生菌对泌乳中后期奶牛饲料表观消化率的影响 瘤胃是反刍动物主要的消化器官，绝大部分的碳水化合物和蛋白质在瘤胃被降解，尤其是纤维的降解完全依赖于瘤胃微生物分泌的纤维降解酶。益生菌能够调节瘤胃发酵，并且有些益生菌还能够分泌外源降解酶，提高日粮降解率。付晓政等[13]研究发现，由乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌等组成复合益生菌饲喂泌乳中期的荷斯坦奶牛能够显著提高CP 和EE 的表观消化率。Francia等[14]报道，米曲霉能够通过改善瘤胃降解纤维的效率增加对饲料的消化能力，产生的酶可以促进纤维分解菌将纤维转化为单糖。邓露芳[15]研究发现，用纳豆芽孢杆菌饲喂泌乳中期的瘘管荷斯坦奶牛24 h 后，瘤胃中淀粉分解菌和蛋白分解菌的数量分别提高11.8% 和16.2%。本试验中，试验组CP 的表观消化率较对照组显著提高，一方面可能是复合益生菌改变了瘤胃微生物菌群的结构和组成，蛋白分解菌属（如普雷沃菌属比例）增加，另一方面可能受益生菌分泌外源酶的影响。

3.3 复合益生菌对泌乳中后期奶牛瘤胃发酵参数的影响 瘤胃pH 是衡量瘤胃发酵情况的直观指标。本试验发现，复合益生菌对瘤胃pH 无显著影响，但试验组瘤胃pH 略低于对照组，其原因可能与试验组的TVFA 生成量高于对照组有关。瘤胃VFA 是反刍动物主要能量来源。Rosenberger 等[16]认为，当瘤胃VFA 浓度在60～120 mmol/L时，反刍动物能够维持正常的生长代谢。本试验中VFA浓度处于较合理的区间范围。丁洪涛等[9]通过体外发酵发现，枯草芽孢杆菌提高VFA 产量，降低乙酸/丙酸。本试验中虽然TVFA 浓度无统计学差异，但试验组比对照组提高了7.63%，说明复合益生菌能够促进瘤胃微生物发酵，为动物生产提供更多能量。

饲料中的部分蛋白质进入瘤胃后被分解生成NH3-N，然后被微生物利用合成MCP。Sun 等[17]在利用米曲霉体外发酵中国野生黑麦和玉米青贮的试验中发现，米曲霉能够极显著提高不同饲料来源瘤胃液中的MCP 浓度。本试验同样发现添加复合益生菌显著提高瘤胃液MCP 浓度。一方面可能是复合益生菌刺激瘤胃发酵产生更多的NH3-N，促进了微生物合成MCP；另一方面芽孢杆菌通过生物夺氧效应消耗随饲料进入瘤胃的氧气，维持厌氧环境，有利于瘤胃微生物的生长繁殖，从而促进营养物质消化吸收和MCP 的合成。

3.4 复合益生菌对泌乳中后期奶牛瘤胃细菌组成的影响本研究利用高通量测序技术探究复合益生菌对奶牛瘤胃细菌组成和结构的影响。根据α分析的结果，添加复合益生菌对瘤胃细菌的丰富度和多样性无显著影响。对照组和试验组中拟杆菌门均为主要优势菌门，厚壁菌门为第二优势菌门，这与Jami 等[18]对荷斯坦奶牛瘤胃细菌组成的高通量测序结果一致。拟杆菌门在瘤胃中的主要作用是分解蛋白质和碳水化合物，其中普雷沃氏菌属、毛螺菌属、拟杆菌属在蛋白质降解、肽的吸收利用中起重要作用[19]，试验组中这3 个菌属的相对丰度高于对照组可能是CP 降解率提高的原因之一。虽然对照组和试验组拟杆菌门相对丰度没有显著差异，但试验组的拟杆菌门中普雷沃菌属比对照组高38%，同时琥珀酸菌属的丰度也显著高于对照组，普雷沃菌属能够分解淀粉和蛋白质产生琥珀酸和乙酸[19-20]，琥珀酸菌属能够利用琥珀酸生成丙酸[21]。因此，复合益生菌可以通过促进普雷沃菌属和琥珀酸菌属的增殖提高丙酸产量，改变瘤胃发酵模式。

厚壁菌门的主要功能是促进纤维物质的消化吸收[22]。瘤胃球菌属属于厚壁菌门，能够产生大量的纤维素酶和半纤维素酶降解植物纤维；琥珀酸菌属是纤维降解菌属，其中产琥珀酸丝状杆菌和产琥珀酸拟杆菌具有很强的纤维分解活性，能够降解瘤胃球菌属中黄白瘤胃球菌不能降解的纤维素[23]。因此，试验组中高相对丰度的瘤胃球菌属和琥珀酸菌属在一定程度上引起NDF 表观消化率的提高。

4 结 论

复合益生菌对瘤胃细菌的丰富度和多样性无显著影响，但是可以提高瘤胃球菌属和琥珀酸菌属的相对丰度，改善瘤胃发酵，提高瘤胃液微生物蛋白合成，促进粗蛋白和纤维降解，进而提高奶产量。