宋朋杰,武小虎,张世栋,王东升,邵 丹,李亚娟,闫文军,严作廷∗ (.中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所/农业部兽用药物创制重点实验室/中国农业科学院临床兽医学研究中心,甘肃 兰州730050;.广西大学 动物科技学院,广西 南宁530000)

奶牛子宫内膜炎多发于产后,奶牛分娩后子宫腔受到细菌污染,致病菌持续存在,突破机体的防御屏障引起子宫浅表炎症,危及子宫正常功能,导致子宫疾病[1]。子宫细菌污染是导致不孕不育的1个关键原因,如果发现和治疗不及时极易引起子宫病变,从而造成奶牛产犊期延长,产奶量下降,甚至不孕和死亡。给我国乃至世界奶牛产业带来巨大的经济损失。正常母牛在怀孕之前必须排出胎衣、恶露,完成子宫复旧,子宫内膜再生,恢复正常的卵巢活动周期[2]。如果产后病原菌排出不及时,极易引起子宫内的炎症,根据炎症持续时间长短可分为子宫炎和子宫内膜炎。在奶牛分娩1 周后子宫内出现炎症,阴道内流出有清亮或伴有少量脓性分泌物的液体,但是在分娩21 d内自愈的称为子宫炎[3]。分娩后21 d或更长时间经直肠触诊宫颈直径大于或等于7.5 cm,阴道内可检测到脓性(脓性分泌物大于50%)分泌物,或26 d 后阴道内可检测到脓性黏液(脓性物约占50%)分泌物为子宫内膜炎[4]。国内外学者研究表明子宫内膜炎的病原菌主要有大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、化脓链球菌、无乳链球菌、化脓棒状杆菌、拟杆菌和梭菌等[5]。目前临床上对该病的治疗还是以抗生素为主,但抗生素易产生耐药性及药物残留,这就给下一步的治疗带来阻力。虽然纯中药制剂能防治奶牛子宫内膜炎,但见效慢,给药量难以控制,而且中药有效成分提取过程繁琐,成本高。由于微生态制剂绿色安全,无残留、无副作用、成本低,是最理想的抗生素替代品之一。

1 奶牛子宫内膜炎的发病机理

奶牛子宫内膜炎是病原菌侵入子宫内而引起的的子宫内膜层发生的炎症。部分革兰阴性菌的菌毛、外膜蛋白以及紧密素等与子宫内膜上皮细胞的受体相结合,子宫内膜上皮细胞的模式识别受体(PRRs)如:TLRs(toll-like receptors)、NLRs(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors)等识别病原菌的特征性分子结构,激活体内的免疫反应,如果子宫的解剖屏障和功能屏障以及特异性免疫和非特异性免疫不足以消灭病原菌的时候,这些病原菌就在子宫内定植下来大量繁殖,释放外毒素如细胞毒素、热敏肠毒素、耐热肠毒素等,对靶细胞产生毒性作用,引起子宫内膜的炎症反应,体内IL-6、IL-18、IL-β、TNF-α等细胞因子含量升高。革兰阳性菌能产生溶血素、凝固酶、耐热核酸以及多糖抗原等毒力因子,常引起化脓性炎症。一些革兰阳性菌如金黄色葡萄球菌能产生抗原蛋白与IgG相结合形成具有抗逆性的复合物,抵抗吞噬细胞的吞噬、损伤血小板、引发过敏反应、促进细胞分裂等造成子宫炎症反应的产生。免疫功能低下,BRODZKI等[6]对患有亚临床子宫内膜炎的奶牛进行研究,与健康正常分娩的奶牛相比患有亚临床子宫内膜炎的奶牛外周血和子宫冲洗液中巨噬细胞和单核巨噬细胞的含量显著降低,并且CD4＋,CD14＋,CD25＋的含量也显著降低,细胞免疫功能障碍可能是导致亚临床子宫内膜炎的主要因素。菌群失调,据报道产后不同阶段健康和患子宫内膜炎奶牛子宫菌群结构的演替规律,患病牛相关微生态菌群与正常奶牛相比菌群严重失调,一些厌氧的优势菌群如乳酸菌等所占比例明显减少,菌群变化异常明显[7]。SHELDON[8]认为虽然细菌感染是奶牛临床子宫内膜炎的主要原因但是产后营养不良、胎衣不下、代谢应激等是导致奶牛子宫内膜炎重要因素,分娩后奶牛水盐流失严重,机体虚弱对营养要求相对较高,如果不能及时补充则导致机体整体状态下降,造成产后子宫疾病的发生。

2 微生态制剂的概念及种类

微生态学是德国RUSH 博士[9]1977年首次提出的一门新兴学科,微生态制剂即微生态调节剂,能调整机体局部微生态失调,提高机体免疫力,由益生菌及其代谢产物经特殊加工制成的一类生物制品。到目前为止微生态制剂可分为3 类:益生菌、益生元、合生元。国内也研发出各种中草药-微生态制剂。

2.1 益生菌制剂益生菌是世界所公认的绿色添加剂,常用的益生菌有:乳酸菌、双歧杆菌、酵母菌、嗜热链球菌、芽孢杆菌等[10]。益生菌具备以下特点:1.安全无致病性。2.对宿主有益生作用,无毒副作用。3.能在宿主胃肠道或者生殖道稳定定殖和代谢。4.具有良好的抗逆性,在正常运输过程中不会失活[11]。正常的皮肤、呼吸道、生殖道、肠道等常年定植着数以万计的微生物菌群,他们相互作用,或免疫排斥或互利共生共同维持着机体的健康水平。当动物机体患病后一些部位的正常菌群会发生紊乱失调,尤其是发生在生殖道和肠道疾病时这种变化更加明显[12]。将植物乳杆菌与枯草芽孢杆菌添加到犊牛饲料中,犊牛日增重提高了9.31%,7.33%,饲料转化率降低11.47%,10.39%,但是随着犊牛日龄的逐渐增加犊牛增重优势逐渐减弱[13]。魏娜[14]从健康仔猪中分离的乳酸菌用于预防仔猪细菌性腹泻,改善仔猪断奶应激反应,并且极大降低料肉比,显著促进仔猪的生长。王恒毅等[15]对10 000只肉雏鸡饲料里添加微生态制剂,与对照组相比试验组肉鸡存活率提高了0.2%,平均体质量增加了0.14 kg,料重比降低了0.06,具有很好的经济效益。

2.2 益生元益生元是不可被胃肠道消化的促进胃肠道及生殖道有益菌生长繁殖的有益物质[16]。益生元为益生菌提供生长所需的营养物资,抑制有害菌的生长,诱导激素分泌从而达到维持生殖道和肠道菌群平衡,增加机体免疫力促进免疫球蛋白的分泌,降低一些致病性大肠杆菌、沙门菌等致病菌的感染[17]。益生元大多数属于非淀粉的低聚糖、多糖、多元醇、植物中药提取物等。由于益生元体外加工提取步骤繁琐,工艺复杂,成本较高,在兽医临床还很少应用。

2.3 合生元合生元是益生菌和益生元的组合,益生元容易被益生菌消化利用有助于益生菌的生存。合生元调节生殖道健康的功能主要包括抑制病原菌的定植和繁殖、调节生殖道菌群平衡、保护子宫内膜和生殖道黏膜免疫屏障功能、提高机体免疫力、下调炎症因子等,从而有益于宿主的健康[18]。

2.4 中草药微生态制剂中草药微生态制剂是在微生态学的理论指导下将中草药或提取物与一种或多种益生菌共同发酵转化成含有中药活性成分或菌体代谢产物,能够调节机体菌群平衡、抑制病原菌的生长繁殖、增强机体免疫力的新型微生态制剂。谢全喜等[19]研究发现鼠李糖杆菌和枯草芽孢杆菌发酵的中草药制成新型中草药微生态制剂能使黄羽肉鸡抵抗大肠杆菌的感染,并且对脾脏和法氏囊发育没有影响。于佳民等[20]发现中草药复合微生态制剂对蛋鸡急性肝脏损伤有很好的治疗作用,能减少肉鸡肝细胞坏死,降低血清转氨酶活性。蒋小强等[21]研究发现中草药红茶菌具有多种抗口蹄疫的作用机制,对猪口鼻喷雾中草药红茶菌微生态制剂后可防止口蹄疫的传播和发生,这对建立口蹄疫非免疫无疫区有很重要的意义。

3 微生态制剂防治奶牛子宫内膜炎应用

目前国内用于防治奶牛子宫内膜炎的微生态制剂都在研发阶段,市场上还未出现防治奶牛子宫内膜炎效果较好的微生态制剂。研究发现患有临床和亚临床子宫内膜炎奶牛的子宫微生物群多样性很复杂,产后健康奶牛子宫内以乳酸菌和不动杆菌为主,患病牛子宫中没有发现乳酸菌的存在[22],菌群失调可能是奶牛子宫内膜炎发病原因之一。PETER等[23]对产后24～30 d的56头奶牛子宫灌注布氏乳杆菌,结果显示与对照组的60头牛相比子宫内膜炎性因子IL-1β、IL-8等明显降低,并且试验组受孕率有所提高,布氏乳杆菌对改善子宫环境、对子宫良好的生殖功能具有促进作用。OTERO 等[24]从健康奶牛生殖道内分离纯化出76 株乳酸菌,76株乳酸菌中大多数都能抑制牛源大肠杆菌,少数能抑制患有奶牛子宫内膜炎子宫分离出的产脓放线菌,通过筛选对奶牛子宫内膜炎特异性病原体具有抑制作用的乳酸菌研制出1种防治奶牛子宫内膜炎的微生态制剂。张志焱等[25]用微生态制剂对泰安地区患子宫内膜炎的20头奶牛进行治疗,有效率95%,治愈率75%,具有显著地治疗效果。薛洋洋[26]从健康奶牛子宫内分离出乳酸菌,制成微生态制剂,对10头患病奶牛进行治疗,治愈4头、有效2头,有效率达60%。

4 微生态制剂防治奶牛子宫内膜炎机制探究

乳酸菌是益生菌的一种,它是健康奶牛生殖道、胃肠道、呼吸道内的优势菌群,乳酸菌竞争性黏附在宿主细胞表面通过产生乳酸、过氧化氢、细菌素等来抑制或杀死病原菌从而达到抑菌目的[27]。近些年来微生态制剂在奶牛生殖疾病方面的研究和应用越来越热,尤其是在改善生殖道微生态环境和饲料添加方向。

4.1 增强机体免疫力,降低炎症反应按照传统的观点机体免疫系统的进化是为了阻止微生物的定植,但是在动物生殖道内能耐受复杂的细菌共生,这些复杂的微生物可以从Ig A 中获益以建立黏膜细菌群,他们与机体共生从而增强机体免疫力[28]。乳酸菌在体内对先天性免疫进行调节,通过NF-k B途径和p38 MAP途径激活机体先天免疫从而控制炎症反应的发生[29]。刘明超[30]研究发现鼠李糖乳杆菌GR-1改善了大肠杆菌诱导的细胞超微结构破坏,从而降低了子宫内膜上皮细胞凋亡的百分比,通过减弱My D88 依赖和My D88 独立的通路激活限制炎症反应。罗茜[31]研究发现微生态制剂可以维持肠道生殖道、微生物菌群平衡、增强免疫力、促进生长、防控疾病等益生能功。鼠李糖乳杆菌GR-1对大肠杆菌诱导的牛原代子宫内膜上皮细胞损伤和炎症具有保护作用,鼠李糖乳杆菌GR-1减少了大肠杆菌诱导的原代子宫内膜上皮细胞超微结构的改变,限制了炎症反应的产生,使细胞凋亡的百分比明显下降[32]。鼠李糖乳杆菌、乳酸片球菌、罗伊乳酸杆菌和清酒乳酸杆菌能调节子宫内膜上皮细胞被大肠杆菌感染后引起的炎症反应,清酒乳酸杆菌和罗伊乳杆菌对预防大肠杆菌的感染有良好的作用(分别为87%,78%,P＜0.001),在鼠李糖乳杆菌的存在下大肠杆菌的感染明显降低,与乳酸片球菌相比促炎细胞因子IL-8和IL-1β的表达显著下降(P＜0.001),乳酸菌在调节牛子宫内膜感染和限制炎症反应具有明显的作用[33]。孙海英等[34]研究复合微生态制剂对子宫内膜炎家兔模型治疗效果,微生态制剂治疗组与对照组相比具有明显的治疗效果,与对照组相比炎症反应明显减弱,有效率达95%以上。GÄRTNER 等[35]从健康奶牛子宫内分离出乳酸杆菌,体外与子宫内膜上皮细胞共同培养,发现乳酸菌存在的情况下子宫内膜上皮细胞促炎性因子明显减少。KUMMER 等[36]用筛选的2 株乳酸杆菌CCM 1753和G013对发情后8～12 d 的8头奶牛进行子宫注射,在注射后的第6,12天进行子宫内膜组织采样,与空白对照组相比这2株乳酸杆菌对子宫内膜的影响无显著性差异,但各种免疫细胞的数目明显增加,单核细胞的沉积导致子宫内膜上皮细胞有明显的细胞浸润现象,肥大细胞和巨噬细胞浸润也非常显著,乳酸杆菌刺激机体产生细胞免疫,这2株菌对致病菌有明显的抑制作用,有望用于临床上对奶牛子宫内膜炎的预防和治疗。

4.2 黏附占位,维持菌群平衡黏附力的大小是评价1株益生菌很重要的标准之一,黏附力越强说明其在动物机体内生存下来的可能性越大在,筛选益生菌的过程中,黏附性作为筛选乳酸菌的第1 步。目前研究发现乳酸菌表面的黏附素即:脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸以及S-层蛋白等在黏附过程中起到一定的作用[37]。益生菌可以利用多种直接具有黏附功能的蛋白质而向生殖道黏附,如黏液结合蛋白、黏附素等,或来源于中间代谢产物的某些蛋白质参与黏附作用[38],益生菌与病原菌竞争性的与上皮细胞上的受体相结合使病原菌的感染量大大降低。健康产后奶牛阴道细菌菌群以乳酸菌为主,而患子宫内膜炎的产后奶牛阴道菌群中没有优势菌种,WANG等[39]检测健康奶牛和患子宫内膜炎奶牛阴道内菌群多样性,与健康奶牛相比,患子宫内膜炎奶牛阴道菌群多样性更强,缺乏优势菌种,正常菌群的破坏可能是子宫内膜炎发病的原因之一。白东宁[40]研究发现3株乳酸菌(嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、盲肠球菌)对拮抗大肠杆菌黏附子宫内膜上皮细胞具有很好的效果,其中嗜酸乳杆菌对大肠杆菌的黏附拮抗作用最强,使大肠杆菌(C83903)的黏附率由38.33% 下降至9.95%,盲肠球菌和粪肠球菌对金黄色葡萄球菌的黏附率由86.18%降低到8.71%,8.63%,乳酸菌通过竞争黏附减少大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的感染具有很好的效果。

4.3 调节子宫、生殖道p H 值,抑制病原菌增殖

4.3.1 产乳酸、H2O2乳酸菌属于乳酸菌属,在健康动物的生殖道和胃肠道中已经分离出产酸、产H2O2和细菌素的乳酸菌。奶牛子宫和阴道内的乳酸菌通过产生乳酸、H2O2以及细菌素来抑制病原菌的生长,乳酸菌通过产生H2O2来激活肠道的过氧化物酶-硫氰酸盐反应系统,来参与肠道中抑菌的过程,这可能与乳酸菌产生的H2O2能够调节PPAR-γ(过氧化物酶体增殖物激活受体)的活性,提高PPAR-γ的表达有关[41]。OTERO 等[42]从健康奶牛阴道内分离的乳酸菌经过检测后发现这种乳酸菌能分泌酸和H2O2,并且具有良好的抑菌效果,对预防金黄色葡萄球菌感染就有良好的效果。子宫灌注大肠埃希杆菌引起的家兔子宫内膜炎模型,临床分离株唾液乳杆菌和魏斯菌组合治疗家兔病理模型,有效率为80%,治愈率为60%,唾液乳杆菌和魏斯菌组合制备微生态制剂能够用于防治临床奶牛子宫内膜炎[43]。GENÍS等[44]对经产的20 头健康奶牛进行试验,在3 周时间内对10 头奶牛阴道内每周2次使用鼠李糖杆菌、乳酸片球菌和罗伊乳杆菌复合制剂,另外10头用无菌生理盐水以同样的方法处理阴道,3 周后收集子宫分泌物,分析10个与先天免疫和感染有关的基因表达情况,结果显示试验组和对照组IL-8、IL-1β和IL-6的分泌差异不显著,在奶牛阴道没有感染的情况下乳酸菌组合物应用于阴道时无法到达子宫,无法调节子宫先天免疫,乳酸菌可能通过产生代谢物来调节阴道内的致病环境从而达到抑菌的目的。

4.3.2 产细菌素 细菌素是某些乳酸菌在代谢过程中产生的具有抑菌活性的多肽或前体肽,通过靶细胞穿孔,耗散细胞膜质子移动势,增加细胞膜通透性,形成孔洞,进而破坏细胞膜完整性,使小分子物质(K＋和无机磷离子)和大分子物质(ATP)同时泄漏并最终瓦解细胞,达到杀菌或者抑菌的目的[45]。乳酸菌细菌素主要对革兰阳性菌有高效的抑制作用,乳酸菌细菌素通过与细胞膜受体特异性结合,促进细菌素在目标细菌的细胞膜上形成“核结构”,破坏细胞膜的完整性,造成目标细菌的质子动力的消散,从而达到抑菌的目的[46]。赵瑞香等[47]研究发现嗜酸乳杆菌产生的细菌素Lactobacillin-XH2作用于大肠杆菌后使菌体细胞变形,细胞膜通透性增大,胞内大量K＋快速流失,使菌体代谢失常,最终导致死亡。赵圣明[48]从植物乳杆菌代谢物中分离出细菌素对芽孢杆菌具有明显的抑制作用,经细菌素处理后,蜡样芽孢杆菌芽孢形成相关的重要调控基因sig E、sig F、sig K和sigG的表达下调,芽孢形成不同阶段的芽孢形成基因rac A和cotE等也明显的下调,该细菌素能明显抑制蜡样芽孢杆菌芽孢的形成。

5 展望

奶牛子宫内膜炎一直阻碍着奶牛行业的发展,每年给全球造成巨大的经济损失,在畜牧行业抗生素作为主要的疾病治疗药物和饲料添加剂被广泛使用。随着抗生素的大量使用病原菌抗菌谱的不断增大,耐药基因逐渐增多,如何减少抗生素的使用、如何减少耐药菌的产生,成为人们研究的热点。子宫健康对奶牛成功繁育具有非常重要的意义,如何在减少抗生素使用的情况下控制奶牛子宫内膜炎的发生成为奶牛行业研究的热点。微生态制剂以新的理念和方法提出了一种全新的治疗和防治策略,其无毒、无害等优点日益受到科研工作者的重视。微生态制剂通过增强机体免疫力、与病原菌竞争性黏附占位、代谢产物抑制病原菌的生存繁殖等达到防治奶牛子宫内膜炎的目的。许多益生菌代谢产物具有抑菌作用,比如细菌素、小分子肽等,如果能借助宏基因组、转录组、代谢组等多组学分析手段,利用基因工程菌将这些抑菌物质批量生产,定会给奶牛业乃至畜牧养殖业带来不可估量的经济效益。将益生菌和中草药共同发酵,发挥益生菌无毒无残留和中草药无耐药的特性,将成为研发新型、绿色微生态制剂的发展方向。

因此临床筛选抗菌性强,黏附率高,安全性好的益生菌来降低预防和治疗成本、控制耐药基因产生、开发绿色全新型微生态制剂将是未来研究的主要方向。但是益生菌与子宫内膜上皮细胞的黏附机制,一些细菌素、小分子肽抑菌机制尚不完全清楚,许多空白留待探索。研制一种理想的复合微生态制剂既能抑制子宫内膜炎病原菌的感染又对奶牛无毒无害作用,具有很大的研究开发前景。一些微生态制剂的研究成果已经在人医临床上展开应用,尤其在治疗女性生殖道疾病和肠道疾病方面应用十分广泛,并且取得患者的公认。剂鉴于国内外微生态制剂的研究热潮及微生态制剂在奶牛领域的研究越来越深入,我们相信通过微生态领域和奶牛领域的相互渗透,一定能研究出更好的微生态制剂,为奶牛行业、畜牧行业做出应有的贡献。