彭梦玲 董 静 刘 琦 胡文业 张粟子 王菊花 周 杰

(安徽农业大学 动物科技学院，合肥 230036)

因环境温度超过等热区(Thermoneutral zone)上限，导致动物的非特异性反应称为热应激[1]。热应激是制约肉鸡养殖业生产效率的主要因素之一[2]，主要表现在：肉鸡在采食量、饲料转化率、生长速度的显著下降；同时伴有生理机能紊乱的发生[3-4]。研究表明持续或间歇性高温可对鸡营养代谢利用、肠道菌群、生理免疫等产生综合负面影响[5-7]，尤其容易引起脂肪沉积[8-9]。

稀土壳糖胺螯合盐(Rare earth-chitosan chelate，RECC)具有类似抗生素作用，主要以稀土硝酸盐与壳糖胺为原料，经特殊电化学工艺加工而成，安全性高，是一种新型饲料添加剂[10]。RECC可提高禽类和反刍动物的饲料利用率，并促进其体内生长因子和激素的释放，进一步增加机体免疫力[11-12]。RECC可促进蛋鸡新陈代谢，提高产蛋率[13]。

ATP结合盒转运体G1(ATP binding cassette transporter G1，ABCG1)是ATP结合盒转运体(ATP binding cassette transporter，ABC)超家族中的一员。ABCG1通过消耗ATP介导蛋白质、胆固醇、磷脂等多种物质的跨膜转运，主要存在于细胞膜上[14]。已有研究表明ABCG1可介导胆固醇外排，并缓解巨噬细胞氧化应激反应[15]。此外，ABCG1可通过抑制巨噬细胞中脂质过量积累防止动脉粥样硬化的发生[16,17]。热应激可导致脂肪沉积，ABCG1可抑制脂肪沉积。然而，RECC对热应激肉鸡脂肪沉积的影响却鲜有报道，且RECC是否影响热应激条件下ABCG1mRNA表达水平仍然未知。因此，本研究拟从脂肪组织学角度探讨RECC对热应激条件下肉鸡脂肪沉积的影响，以黄羽肉鸡为研究对象，利用组织学和实时荧光定量(qRT-PCR)方法，检测RECC对热应激处理下皮下、肌内和内脏脂肪细胞大小及ABCG1mRNA表达的影响，以期探明RECC是否通过ABCG1mRNA表达的变化影响热应激导致的脂肪沉积，为RECC进一步在禽类热应激中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取90只1日龄黄羽肉鸡(合肥立华畜禽有限公司)，按照饲养标准饲养至29日龄，开始进行热应激处理。肉鸡随机分为3组：对照组(饲养温度25±0.05 ℃+基础日粮)、热应激组(饲养温度37±0.05 ℃+基础日粮)和RECC组(饲养温度37±0.05 ℃+基础日粮+0.03% RECC)，每组30 只。热应激处理时间分别7 d和14 d。

1.2 主要试剂及仪器

稀土壳糖胺螯合盐由武汉楚兴国盛科技有限公司提供，稀土有效成分为镧和铈，稀土壳糖胺螯合盐含量≥45%。Total RNA Kit II(OMEGA)、RNA Loading Buffer(上海生物工程有限公司)、cDNA反转录试剂盒(TaKaRa)、2×TaqPCR MasterMix(TIANGEN)、核酸染料(TIANGEN)、DNA Marker(TIANGEN)、5×TBE buffer(上海生物工程有限公司)。

主要仪器有：荧光倒置显微镜(37XB，上海光学仪器六厂)；PCR仪(MJ Mini伯乐，美国)；高速冷冻离心机(2K-15，珠海黑马科技有限公司)；高压蒸汽锅(SYQDSX-280，上海申安医疗器械厂)；酶标仪(EON，美国伯腾仪器有限公司)；手掌型离心机(LX-100，江苏其林贝儿仪器制造有限公司)。

1.3 采样及切片制备

分别在热应激处理的第7 天和第14 天，每组随机选取15 只鸡进行屠宰，屠宰前给鸡禁食12 h，采集其皮下(颈部)、内脏(肌胃周围)和肌间(腿肌)脂肪组织，在Bouin液中固定24 h，进行HE染色，染色程序如下：组织修块(约为1.5 mm×1.5 mm×3 mm)后，放入脱水筐中，流水冲洗过夜；用梯度酒精进行脱水，浓度依次为75%、85%、95%、95%、100%和100%，每个浓度45 min；将组织块放入二甲苯溶液中约30 s，再放入盛有液体蜡的烧杯中浸蜡，60 ℃ 3 h；用镊子取出组织块，放入包埋筐中，并倒入溶化后的液体蜡，动作要迅速；待蜡凝固后，以 5 μm 厚度进行切片，在50 ℃水中平展后粘附到载玻片上，并置于60 ℃恒温箱中3 h；将含有组织的载玻片按照以下顺序进行染色：二甲苯溶液(10 min)、二甲苯溶液(10 min)、100%酒精(5 min)、95%酒精(5 min)、95%酒精(5 min)、85%酒精(5 min)、75%酒精(5 min)、苏木精(5 min)、水中轻晃漂洗、1%盐酸(5 s)、流水冲洗(10 min)、伊红(1 min)、流水冲洗(1 min)、75%酒精(5 min)、85%酒精(5 min)、95%酒精(5 min)、95%酒精(5 min)、100%酒精(5 min)、二甲苯(5 min)、二甲苯(5 min)；封片，晾干后，用显微镜进行拍照。

1.4 ABCG1 mRNA表达水平检测

脂肪组织总RNA提取方法参照OMEGA公司Total RNA Kit试剂盒说明书，利用Nandrop测定总RNA浓度和纯度。取2 μg总RNA进行反转录，反应体系和参数设置参照试剂盒说明书进行。获得cDNA后，对内参基因及目的基因mRNA进行相对定量分析，即2-ΔΔCT法。本试验以β-肌动蛋白(β-actin)为内参，引物序列为：5′-AGACATCAGGGTGTGATGGTTGGT-3′(上游)，5′-TCCCAGTTGGTGACAATACCGTGT-3′(下游)，产物大小为125 bp。脂联素引物序列为：5′-CTGGGTACAGGAGGAAGC-3′(上游)，5′-GAAGGACAAGGCAGTGATC-3′(下游)，产物大小为194 bp。ABCG1引物序列为：5′-AGATGAGGAAGGAGCATG-3′(上游)和5′-TCAGGGAAGTTCAGCAGT-3′(下游)，扩增产物大小为203 bp。反应参数设置为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共39 个循环，反应体系为20 μL。引物在Primer Prime 5.0软件上设计，由上海捷瑞生物技术有限公司合成。

1.5 计数及统计分析

Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics Inc. Rockville MD，美国)软件计数单个视野中的脂肪细胞数目，并测量脂肪细胞直径(μm)平均值(用像素点的数目表示)。每份标本测量5 个视野。采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析，分析方法为t检验，分析结果以平均值±标准差(Mean±SD)表示。差异显著为P<0.05，差异极显著P<0.01。

2 结果与分析

2.1 热应激及RECC对不同部位脂肪细胞形态的影响

热应激分别处理黄羽鸡1和2周后，皮下、肌内和内脏脂肪组织HE染色结果如图1和图2所示：

(a)皮下脂肪细胞；(b)内脏脂肪细胞；(c)肌间脂肪细胞。Ⅰ 对照组；Ⅱ 热应激组；Ⅲ RECC组。(a) Subcutaneous adipocytes; (b) Visceral adipocytes; (c) Intermuscular adipocytes. Ⅰ Control group； Ⅱ Heat stress group； Ⅲ RECC group.图1 各组黄羽肉鸡热应激1周后脂肪组织HE染色结果对比(400×，标尺=50 μm)Fig.1 HE staining of the fat tissues of yellow-feathered broilers treated with thermal stress for 1 week (400×, scale bar=50 μm)

(a)皮下脂肪细胞；(b)内脏脂肪细胞；(c)肌间脂肪细胞。Ⅰ 对照组；Ⅱ 热应激组；Ⅲ RECC组。(a) Subcutaneous adipocytes; (b) Visceral adipocytes; (c) Intermuscular adipocytes. Ⅰ Control group； Ⅱ Heat stress group； Ⅲ RECC group。图2 热应激2周脂肪组织HE染色结果(400×，标尺=50 μm)Fig.2 Results of HE staining of fat tissues treated with thermal stress for 2 weeks (400×, scale bar=50 μm)

与对照组相比，肉眼可见各部位脂肪细胞直径在热应激组有增大；经RECC处理后，各部位脂肪细胞直径减小，需进一步统计分析。

2.2 热应激及RECC对不同部位脂肪细胞半径的影响

为分析显微镜下观察到的结果的准确性，进一步利用Image-Pro Plus 6.0分别对各处理组皮下、肌内和内脏脂肪细胞大小及数量进行统计，结果见表1。热应激1 周后，与对照组相比，肌间脂肪细胞直径在热应激处理组增大了12.12%(P<0.01)；与热应激处理组相比，肌间脂肪细胞直径在RECC处理组显著减小了23.27%(P<0.01)。皮下脂肪和内脏脂肪细胞直径在热应激处理组，与对照组相比无显著变化；而皮下脂肪和内脏脂肪细胞直径在RECC处理组与热应激组相比分别减小了20.71%(P<0.01)和14.87%(P<0.01)。本研究结果表明热应激1 周可显著增大肉鸡肌间脂肪细胞直径，对皮下和内脏脂肪细胞直径变化无显著影响；RECC可显著减小皮下和内脏脂肪细胞直径。

热应激2周后，皮下脂肪细胞直径大小在各处理组均无显著变化(表2)。与热应激组相比，内脏脂肪细胞直径大小在RECC处理组显著减小了9.00%(P<0.05)；与对照组相比，肌间脂肪细胞直径大小在热应激处理组显著增大了12.83%(P<0.01)，而用RECC处理后与热应激组相比显著减小了14.18%(P<0.01)。表明RECC对热应激处理两周导致的内脏和肌间脂肪细胞直径增大具有一定抑制作用，而热应激和RECC对皮下脂肪细胞直径无显著影响。

表1 热应激1 周对黄羽肉鸡各部位脂肪细胞直径大小的影响Table 1 Effects of thermal stress on the diameter of fat cells of yellow-feathered broilers μm

表2 热应激2 周对黄羽肉鸡脂肪细胞直径大小的影响Table 2 Effects of two weeks of thermal stress on the diameter of fat cells in yellow-feathered broilers μm

2.3 热应激1周和2周黄羽肉鸡内脏脂肪、皮下脂肪、肌间脂肪脂联素mRNA的表达水平

热应激1周后，皮下脂肪、内脏和肌间脂肪组织中脂联素mRNA表达水平与对照组相比，均显著下降(P<0.05)；与热应激组相比，皮下脂肪和肌间脂肪组织中脂联素mRNA表达水平在RECC处理组显著升高(P<0.05)(图3)。脂联素具有抑制脂肪沉积的作用，其表达水平在RECC处理组显著升高，表明脂肪沉积被抑制(图3)。

*和**分别代表组间差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。下同。* and ** mean significant differences between groups at P<0.05 and P<0.01 levels，respectively．The same below.图3 热应激1周各脂肪组织中脂联素mRNA表达水平Fig.3 Expression levels of adiponectin mRNA in different adipose tissue after one week of thermal stress

如图4所示，热应激2 周后，内脏脂肪组织中脂联素mRNA表达水平与对照组相比，显著下降(P<0.05)，在肌间脂肪组织中极显著下降(P<0.01)；与热应激组相比，肌间脂肪组织中脂联素mRNA表达水平极显著升高(P<0.01)。表明随着热应激处理时间的延长，热应激与RECC对肌间脂肪沉积的影响最为显著。

图4 热应激2周各脂肪组织中脂联素mRNA表达水平Fig.4 Expression levels of adiponectin mRNA in different adipose tissue after two weeks of thermal stress

2.4 热应激1周和2周黄羽肉鸡内脏脂肪、皮下脂肪、肌间脂肪ABCG1 mRNA的表达水平

如图5所示，热应激1 周后，热应激组皮下脂肪和肌间脂肪ABCG1mRNA的表达量显著高于对照组(P<0.05)，RECC组皮下脂肪和内脏脂肪ABCG1mRNA的表达量显著高于热应激组(P<0.05)，极显著高于对照组(P<0.01)，RECC组肌间脂肪ABCG1mRNA的表达量显著高于对照组(P<0.05)。

图5 热应激1周RECC对各脂肪组织中ABCG1基因表达的影响Fig.5 Effect of RECC on the expression of ABCG1 mRNA in different adipose tissue after one week of thermal stress

图6 热应激2周后RECC对不同脂肪组织中ABCG1基因表达的影响Fig.6 Effect of RECC on the expression of ABCG1 gene in different adipose tissue after two week of thermal stress

如图6所示，热应激2 周后，皮下脂肪热应激组ABCG1mRNA的表达量极显著高于对照组和RECC组(P<0.01)，内脏脂肪热应激组ABCG1mRNA的表达量显著高于对照组和RECC组(P<0.05)，肌间脂肪热应激组ABCG1mRNA的表达量极显著高于对照组(P<0.01)。

3 讨论与结论

3.1 热应激对肉鸡脂肪细胞大小的影响

脂肪过度沉积影响胴体品质和人类健康[18]，热应激可促进肉鸡脂肪合成并导致脂肪沉积。Ain等[19]研究发现环境温度为32 ℃时，4～7周龄肉鸡腹脂、皮下脂肪和肌间脂肪沉积率分别增加15%、21%和22%(以活体重计)。脂肪细胞的增大和增殖导致脂肪沉积，动物在胚胎期脂肪组织的生长发育主要由于前脂肪细胞的增生，在出生后主要是脂肪细胞的肥大[20]。CLA减少腹脂沉积主要是通过抑制脂肪细胞肥大而不是脂肪细胞增殖。本试验发现热应激处理1和2周后，肌间脂肪细胞直径与对照组相比显著增加，表明热应激可显著增大肌间脂肪细胞[21-22]。

3.2 RECC对热应激条件下脂肪细胞大小的影响

RECC具有类似于纤维素的结构，在动物体内可以结合饲粮中的脂肪，形成胶体，从而降低脂肪在体内的消化吸收；或者通过提高卵磷脂胆固醇酰基转移酶的活性和调节前体物的合成量；达到降低脂肪沉积的作用[23]。RECC通过影响超氧化物歧化酶活性调节机体脂质过氧化水平，但其对脂肪细胞大小变化的影响仍不清楚[24]。为探讨RECC对热应激条件下脂肪细胞大小的变化，本研究在饲料中添加RECC测定其对热应激条件下肉鸡脂肪细胞大小的影响，结果显示热应激1周后RECC可显著减小皮下脂肪和内脏脂肪细胞直径(P<0.01)，而热应激2周RECC对热应激处理导致的内脏和肌间脂肪细胞直径增大具有一定抑制作用，对皮下脂肪细胞直径无显著影响。表明RECC对各部位脂肪细胞的影响与热应激处理时间密切相关。皮下脂肪细胞直径随热应激处理时间的延长不易被RECC影响。

3.3 RECC和热应激对ABCG1 mRNA表达水平的影响

ABCG1是一种脂质转运体，其活化或过表达可促进细胞内胆固醇外流[25]。Haung等[26]研究发现，ABCG1通过升高细胞内高密度脂蛋白(HDL)的浓度，促进胆固醇外排，从而缓解或抑制动脉粥样硬化。Ooi等[27]和薛嘉虹等[28]研究发现在氧化应激情况下，ABCG1的表达量上调，通过胆固醇外排，从而减少血管内脂肪沉积。在本研究中发现，热应激可导致脂肪细胞的增大，进一步导致脂肪沉积，RECC可缓解热应激导致的脂肪细胞增大。因此，本研究探讨RECC和热应激对ABCG1mRNA表达水平的影响。在热应激条件下，ABCG1mRNA表达量显著高于对照组，表明ABCG1mRNA通过脂质外排，抑制应激条件下脂肪沉积。热应激1 周后RECC组各脂肪组织中ABCG1mRNA表达水平均显著高于热应激组，说明RECC在热应激条件下抗脂肪沉积作用机制之一，可能与上调胆固醇逆转运基因ABCG1mRNA的表达水平有关。值得关注的是，在热应激2 周，RECC组ABCG1mRNA表达水平趋于对照组，表明随着RECC的持续加入脂肪沉积得到抑制。关于RECC与胆固醇逆转运基因ABCG1mRNA表达水平的不同机制及其能否增加胆固醇逆转运率有待深入研究。

综上所述，RECC可通过减小脂肪细胞直径和促进ABCG1mRNA的表达抑制热应激肉鸡体内脂肪沉积。