李佳伟， 吕 寒， 刘 艳， 鲜 新， 丁晓琴， 简暾昱， 任冰如， 陈 剑

〔江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园) 江苏省抗糖尿病药物筛选技术服务中心， 江苏 南京 210014〕

枇杷叶为蔷薇科(Rosaceae)植物枇杷〔Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.〕的干燥叶，为中国常用的传统中药材，味苦，性微寒，具有清肺止咳、降逆止呕、抗氧化、抗炎、降血糖和保肝护肝的功效[1-3]。枇杷叶的主要成分包括黄酮类[4]、三萜酸类[5-7]、倍半萜苷类[8]、多酚[9]和多糖[10]等。现代药理学研究结果表明：枇杷叶中倍半萜苷类成分可缓解高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝[11]，枇杷叶中的倍半萜苷A具有显著的降血糖作用[12]。

本研究以采自10个省(自治区)12个产地的枇杷叶为研究对象，建立高效液相色谱(HPLC)测定枇杷叶中倍半萜苷A含量的方法，并比较不同产地枇杷叶中倍半萜苷A含量的差异，以期为不同产地枇杷叶的采收和开发提供研究基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试枇杷叶于2019年6月采自广西玉林和梧州、浙江兰溪、广东清远和肇庆、江苏南京、四川绵阳、重庆沙坪坝、安徽亳州、河南开封、湖北恩施以及湖南湘西10个省(自治区)的12个产地，经江苏省中国科学院植物研究所任冰如研究员鉴定为枇杷的叶。每个产地采集新鲜成熟枇杷叶1 kg，40 ℃烘干，粉碎后过50目筛，备用。

主要仪器：EL204电子天平〔梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司〕，KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，Milli-QTMAdvantage A10TM超纯水系统(美国Millipore公司)，Dione Ultimate-3000液相色谱仪(配有四元泵、在线真空脱气、自动进样器、紫外检测系统和Chromeleon工作站，美国DIONEX公司)。

主要试剂：倍半萜苷A对照品(自制，纯度95%以上)，甲醇为色谱纯农残级(美国Tedia公司)，超纯水，无水乙醇为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent Nucleosil 100 C18(150 mm×4.6 mm，3.0 μm)；流动相为甲醇-水溶液(体积比65∶35)，流速1.0 mL·min-1；检测波长210 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

1.2.2 标准曲线绘制 精密称取倍半萜苷A对照品适量，用甲醇溶解并配制成质量浓度4.110 mg·mL-1的对照品母液，然后用甲醇将对照品母液梯度稀释成质量浓度2.055、1.028、0.514、0.257、0.128和0.064 2 mg·mL-1的对照品溶液。按照上述色谱条件测定倍半萜苷A的峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，倍半萜A质量(X)为横坐标绘制标准曲线，得到峰面积与倍半萜苷A质量的回归方程为Y=3.006 8X-0.093 8(r=0.999 7)，线性范围为0.000 6～0.041 1 mg。

1.2.3 样品中倍半萜苷A的提取及含量测定 分别精密称取各样品粉末5.00 g，精密加入体积分数80%乙醇100.0 mL，超声(300 W，30 ℃)提取60 min，冷却后过滤，滤液用旋转蒸发仪蒸干后，用甲醇复溶转移至5.0 mL容量瓶中定容，即为供试液。根据峰面积及标准曲线计算样品中倍半萜苷A质量。然后根据公式“枇杷叶中倍半萜A含量=(枇杷叶中倍半萜A质量/枇杷叶质量)×100%”计算枇杷叶中倍半萜A含量。每份样品重复测定3次。

1.2.4 方法学考察

1.2.4.1 精密度考察 取倍半萜苷A对照品溶液，重复进样6次，记录倍半萜苷A对照品的峰面积和保留时间，RSD值分别为0.42%和0.10%，表明仪器精密度良好。

1.2.4.2 稳定性考察 取江苏南京产地样品粉末，按照上述方法制备供试液，分别于配制后0、2、4、8、16和24 h进行测定，RSD值为2.04%，表明供试液在24 h内稳定。

1.2.4.3 重复性考察 取江苏南京产地样品粉末6份，按照上述方法制备供试液，按照上述色谱条件测定倍半萜苷A峰面积，并根据标准曲线计算样品中倍半萜苷A质量，RSD值为0.82%，表明该方法重复性好。

1.2.4.4 加样回收率考察 取广西梧州产地样品粉末(倍半萜苷A含量已知)6份，每份5.00 g，分别加入质量浓度4.110 mg·mL-1倍半萜苷A对照品母液7.5 mL，再加入体积分数80%乙醇100.0 mL，按照上述样品中倍半萜苷A的提取方法和色谱条件测定峰面积，根据标准曲线计算倍半萜A质量，并计算回收率，平均回收率为98.86%，RSD值为1.80%。

1.3 数据统计分析

采用GraphPad Prism 8软件对实验数据进行差异显著性分析。

2 结果和分析

不同产地枇杷叶中倍半萜苷A含量见表1。结果表明：不同产地枇杷叶中倍半萜苷A含量由高到低依次为广西梧州、四川绵阳、广东肇庆、安徽亳州、浙江兰溪、重庆沙坪坝、湖南湘西、江苏南京、湖北恩施、广东清远、广西玉林、河南开封。广西梧州产地枇杷叶中倍半萜苷A含量最高，为1.412 mg·g-1，河南开封产地枇杷叶中倍半萜苷A含量最低，为0.613 mg·g-1，2个产地间存在显著差异；四川绵阳、广东肇庆、安徽亳州、浙江兰溪和重庆沙坪坝产地枇杷叶中倍半萜苷A含量也较高，均高于1.000 mg·g-1。总体上看，与华中地区的河南开封、湖南湘西和湖北恩施产地相比，华南、西南和华东地区的广西梧州、四川绵阳、广东肇庆、安徽亳州、浙江兰溪和重庆沙坪坝产地枇杷叶中倍半萜苷A含量较高。此外，来自同一省(自治区)不同城市的枇杷叶中倍半萜苷A含量也存在显著差异，如广西梧州与玉林产地以及广东肇庆与清远产地。

产地LocalitySGA/(mg·g-1)1)RSD/%广西玉林Yulin of Guangxi0.678±0.008d1.24广西梧州Wuzhou of Guangxi1.412±0.009a0.62浙江兰溪Lanxi of Zhejiang1.092±0.007b0.67广东清远Qingyuan of Guangdong0.682±0.015d2.14广东肇庆Zhaoqing of Guangdong1.137±0.012b1.07江苏南京Nanjing of Jiangsu0.921±0.020c2.16四川绵阳Mianyang of Sichuan1.249±0.036a2.85重庆沙坪坝Shapingba of Chongqing1.036±0.009c0.91安徽亳州Bozhou of Anhui1.093±0.025b2.25河南开封Kaifeng of Henan0.613±0.037d6.00湖北恩施Enshi of Hubei0.848±0.038c4.45湖南湘西Xiangxi of Hunan0.934±0.062c6.59

1)SGA： 倍半萜苷A含量Sesquiterpene glycoside A content. 同列中不同的小写字母表示差异显著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (P<0.05) difference.

3 讨 论

本研究建立了HPLC测定枇杷叶中倍半萜苷A含量的方法，并比较了不同产地枇杷叶中倍半萜苷A含量的差异。结果表明：该方法适于测定枇杷叶中倍半萜苷A含量，操作简便，测定结果线性关系良好，重复性好。

植物次生代谢产物的合成受光照、土壤和大气等因子的调控[13]。倍半萜苷是一类重要的植物次生代谢产物，不同产地的生态环境对其合成和积累有一定影响。与中国南部地区相比，北部地区降水量少，不利于土壤中有机质的输入与积累[14]，这可能是影响植物次生代谢产物合成的一个重要因子。本研究结果显示：不同产地枇杷叶中倍半萜苷A含量差异较大，广西梧州产地枇杷叶中倍半萜苷A含量最高，河南开封产地枇杷叶中倍半萜苷A含量最低，前者为后者的2.3倍，广西梧州可作为枇杷叶优选产地。马哲龙等[15]的研究结果表明：同一产地不同品种和不同采收时期枇杷叶中齐墩果酸、熊果酸和总黄酮的含量存在差异。本研究中，来自同一省(自治区)不同城市的枇杷叶中倍半萜苷A含量存在显著差异，这说明植物次生代谢产物除受到生态环境等外在因子影响外，种内遗传差异以及采收时期也可能对其有较大影响。本研究仅根据产地对枇杷叶中倍半萜苷A含量进行了分析，而枇杷叶中倍半萜苷A的合成受多种因子影响，有待进一步的深入研究。