杨晓梅 陈萌 庞辉 赵杰 王慧杰 韦娇

(广西医科大学基础医学院，广西 南宁 530021)

心脑血管疾病的致病因素是血管损伤和血栓形成，它们的起始环节是血管内皮细胞损伤，而氧化应激、慢性炎症被公认是血管内皮损伤发生发展的重要因素，因此，寻找抗氧化、抗炎等综合疗效高的内皮细胞保护药物，对预防心脑血管疾病有重要的临床价值〔1〕。一氧化氮(NO)是在体内由一氧化氮合酶(NOS)催化产生的产物，它能清除氧自由基，是抗氧化的内皮细胞保护因素，它的含量变化与心血管疾病的发生发展密切关联〔2〕。螺旋藻(Spirulina) 为原核生物，具有丰富的营养价值，发酵酶化后获得一种蛋白激酶，称为螺旋藻激酶(SPK)。SPK具有防止血液凝固和溶解血栓的作用，它可以预防血栓性疾病，并且其作用与调节内皮细胞功能有关。SPK可降低氧化应激时过氧化产物丙二醛(MDA)的含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性〔2～5〕。本实验拟通过过氧化氢(H2O2)建立氧化损伤模型，观察SPK对细胞形态和活力、三磷酸腺苷(ATP)、NO和NOS活性的影响，评价其对血管内皮细胞的保护作用和作用机制。

1 材料与方法

1.1试药试剂与仪器 螺旋藻发酵粉(北海市康福保健品有限公司)；人脐静脉内皮细胞(HUVEC，美国Scien Cell公司)；RPMI1640培养基、胎牛血清(美国GIBCO公司)；Trypsin 1∶250(美国Shellab公司)；ATP、NO、NOS测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。酶标分析仪(Thermo Labsystems公司)；CO2培养箱(美国SHELLAB 公司)；倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)；超净工作台(苏州安泰公司)；Integral 10 纯水仪(美国Millipore 公司)；台式低温离心机(湖南长沙平凡有限公司)。

1.2方法

1.2.1药物的制备 SPK的提取采用水提法：将螺旋藻发酵粉水中浸泡，然后低温离心后收集上清液，使用硫酸铵进行分级盐析后收集沉淀，经透析，冻干，凝胶层析后，冻干保存备用，提取得到的SPK比活为2 631 U/mg〔2〕。

1.2.2细胞培养 HUVEC细胞复苏后，生长于含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养基中，置于37℃、5% CO2的培养箱内常规培养，当生长密度达到90%时开始进行细胞传代。传3～4代，细胞生长稳定后开始实验。

1.2.3实验分组 将传3～4代 HUVEC细胞悬液以5×104/孔接种于96孔板，每孔100 μl，贴壁4 h 后，设置正常组(实验中不加任何物质干扰，完全培养基中正常培养)；模型组(在细胞培养液中加入0.2 mmol/L H2O2进行处理)：阳性对照组〔在细胞培养液中用10 mg/L维生素(Vit)E预处理后，然后加0.2 mmol/L H2O2共培养〕；SPK低、中、高剂量组(在细胞培养液中分别用1、2、3 g/L SPK进行预处理，然后再加0.2 mmol/L H2O2继续共培养),分别于给药后24 h收集细胞培养上清液，-20℃冷冻保存待测。

1.2.4SPK对HUVEC细胞活性的影响 HUVEC细胞悬液接种于96 孔培养板中，正常组和模型组加入无血清培养基，阳性对照组和SPK低、中、高剂量组加入所需药物预孵育12 h；孵育完成后在模型组、阳性对照组和SPK低、中、高剂量组加入浓度为0.2 mmol/L的H2O2进行损伤，时间为4 h，正常组不做药物处理，继续培养24 h。实验结束后，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml) ，继续孵育4 h，去上清加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl/孔，水平摇床振荡，酶标仪490 nm 波长读取各孔吸光度(OD)值。

1.2.5形态学观察 将HUVEC细胞按4×105个接种于12孔板，培养24 h后，按实验分组干预后，在倒置相差显微镜下观察细胞形态。

1.2.6细胞培养液中NO含量的测定 取细胞培养上清100 μl，同时设置空白对照和标准测定管，按说明书步骤进行操作。在波长550 nm 0.5 cm光径，测各管OD值。按说明书计算公式即可得NO含量。

1.2.7细胞培养液中NOS活力的测定 取100 μl收集的上清液，检测步骤按试剂盒说明书，显色后酶标仪在530 nm波长下测OD值，根据OD计算NOS活力。

1.2.8ATP含量测定 按1.2.4方法培养后,收集细胞及培养液进行超声破碎处理获得细胞破裂悬液，利用肌酸激酶催化ATP和肌酸生成磷酸肌酸的原理，用磷钼酸比色法对细胞破碎悬液进行检测。用双蒸水调零，在636 nm波长，0.5 cm光径下，测定样本OD值，按照明书公式即可计算得出ATP含量。

1.3统计学方法 采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验、Games-Howell法、t检验。

2 结 果

2.1SPK对H2O2损伤HUVEC活性的影响 模型组细胞损伤明显，细胞活性下降明显(0.401±0.043)，与正常组相比有显著性差异(0.867±0.033，P<0.05)；阳性对照组细胞损伤减小(0.547±0.053)，较模型组活性有显升高(P<0.05)；SPK 低、中、高剂量组细胞活性明显上升(0.482±0.028、0.531±0.064、0.579±0.074)，与模型组相比，SPK中、高剂量组有显著差异(P<0.05) ，且呈剂量依赖性加强。

2.2SPK对H2O2损伤HUVEC形态的影响 与正常组比较，模型组细胞间缝隙变大，数量有所减少，细胞变形，漂浮(见图1模型组箭头)；而阳性对照组，SPK高、中、低剂量组细胞生长良好，细胞间连接紧密，呈“铺路石”状排列(见图1 SPK中剂量组箭头)。

图1 SPK对H2O2刺激下HUVEC形态学的影响(×100)

2.3SPK对细胞培养液中ATP含量的影响 与正常组相比，模型组的ATP含量明显下降(P<0.05)；与模型组相比，阳性对照组含量明显上升(P<0.05)， SPK低、中、高剂量组的ATP含量均明显上升(P<0.05)，呈剂量效应关系。见表1。

2.4SPK对细胞培养液中NO、NOS含量的影响 与正常组相比较，模型组内皮细胞分泌NO量明显降低(P<0.05)；与模型组相比较，阳性对照组和SPK药物组均能使NO分泌量显著增加(P<0.05)。与正常组比较模型组NOS显著下降，SPK高剂量组及阳性对照组NOS显著高于模型组(P<0.05)，SPK低、中剂量组NOS有上升趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组ATP、NO、NOS含量比较

与正常组比较:1)P<0.05；与模型组比较:2)P<0.05

3 讨 论

在引起心脑血管疾病发病的危险因素中，血管内皮细胞损伤引起血管壁增生、硬化是一个重要的因素，而NO代谢紊乱、氧化应激被认为是引起血管内皮细胞损伤的重要机制。内皮细胞在氧化应激时出现功能失调，导致血小板黏附、聚集，炎性细胞活化产生炎症因子，而多种炎症因子又加重内皮细胞的损伤〔1，2〕。NO是在体内由NOS催化生成的内源性血管舒张因子，它具有抗血小板黏附、抗氧化作用、抗炎性反应、抗平滑肌细胞增殖等作用。NO能清除氧自由基，还能抑制血小板黏附和聚集，阻止内皮细胞表达黏附分子，从而减少炎性细胞与血管壁的黏附，防止血管中膜增生。当血管内皮细胞损伤和功能障碍时，伴随NO生物活性降低，它含量的变化与心脑血管疾病的发展有密切的关系〔6～9〕。NOS是在体内以L-精氨酸为底物催化生成NO的酶，在正常情况下，NO主要由存在于内皮细胞中的内皮型NOS合成。因此，内皮细胞损伤会影响NOS的活性，继而影响NO的含量和生物学作用。有实验证明，当NOS活性增高，引起NO含量增加时，可对抗氧自由基对内皮细胞的损伤〔10〕。

线粒体是一个敏感多变的细胞器，其主要作用是能源物质的氧化和能量转换，ATP是生物体内能量转换的基本载体，ATP 水平提示线粒体功能情况，当内皮细胞损伤时会引起线粒体的功能障碍，这可能是血管损伤引起心脑血管疾病中的中间机制〔1，8〕。本实验通过测定细胞内的ATP水平，了解线粒体的损伤程度及功能情况。本实验结果证明：内皮细胞氧化损伤时，ATP水平下降， SPK对线粒体有一定的保护作用，可减轻过氧化物对内皮细胞的损伤。

本实验通过体外培养内皮细胞H2O2造成的内皮细胞氧化性损伤，可使内皮细胞活力下降，而经过SPK预干预后，减弱了H2O2对内皮细胞的氧化损伤作用，使内皮细胞活力明显增强，ATP水平增加，同时使细胞培养液的NO含量和NOS活性明显增加，可见SPK的保护功能可能通过增加NO含量来实现预防内皮细胞损伤的发生发展。