夏 青，狄 冉，刘艳琴，刘秋月，王翔宇，胡文萍，马 琳，储明星*

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京100193；2.内蒙古乌拉特中旗动物疫病预防控制中心，乌拉特中旗015300)

绵羊(Ovisaries)的发情性状主要受外界光照时间长度周期性变化的影响，这种影响造成世界上绝大多数绵羊为季节性发情品种[1-2]。绵羊为短日照动物，在短日照条件下进行繁殖活动，这是限制绵羊生产效率的重要因素之一。因此，探究绵羊的季节性发情分子机制，找到参与季节性发情调控的基因并将其应用于育种实践，是提高绵羊繁殖力的有效方法之一。

本实验室前期选取了9个中国本地绵羊品种，将这些绵羊分为常年发情组(湖羊、小尾寒羊和策勒黑羊)和季节性发情组(滩羊、欧拉型藏羊、草原型藏羊、山谷型藏羊、乌珠穆沁羊和巴音布鲁克羊)，使用Fst检验[3]进行分析，鉴定选择信号，筛选出135个受选择的基因。定义显著位点为Z(Fst) >5[4-5]，曼哈顿图筛选到可能与季节性发情相关的促甲状腺激素受体(Thyroid-stimulating hormone receptor, TSHR)基因。

TSHR主要在甲状腺细胞表达，在控制甲状腺细胞新陈代谢方面发挥重要作用。TSHR能够维持甲状腺滤泡的正常功能，并促进甲状腺滤泡生长[6-7]。TSHR还可以在下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamic-pituitary-gonadal axis, HPGA)中发挥重要作用，TSHR与下丘脑中的促甲状腺激素β亚基(thyrotrophin β subunit,TSHβ)结合，通过cAMP信号通路使下丘脑室管膜细胞中的的Ⅲ型脱碘酶(type Ⅲ thyroid hormone deiodinase,DIO3)转化为Ⅱ型脱碘酶(type thyroid Ⅱ hormone deiodinase,DIO2)，调控T3与T4的转化，进而调控光周期应答和季节性繁殖[8-10]。

本研究以常年发情的小尾寒羊和季节性发情的苏尼特羊为试验动物，检测在发情相关组织中TSHR基因表达特征以及2个不同品种之间的表达差异，利用SequenomMassARRAY○RSNP技术对TSHR基因内含子上的g.89290286A>G和g.89355312G>A位点突变在季节性发情组和常年发情组共6个品种绵羊中分型，分析上述2个位点的多态性，并与季节性发情性状进行关联，以揭示TSHR基因g.89290286A>G和g.89355312G>A位点与绵羊季节性发情的关系。

1 材料与方法

1.1 基因表达试验样品采集

试验羊来自天津市畜牧兽医研究所畜禽繁育基地饲养的2～3周岁健康的卵巢切除(OVX)母羊。选择在长光照条件下饲养的小尾寒羊(Small Tail Han sheep, STH)和苏尼特羊(Sunite sheep, SNT)各3只。屠宰后，迅速采集垂体、下丘脑和大脑共三种新鲜组织样品，装入2 mL冻存管，并储存在-80 ℃冰箱中备用。

1.2 引物设计

根据NCBI数据库中绵羊TSHR基因序列(GenBank登录号： XM_012180606)，用Primer 3软件设计1对荧光定量引物，内参基因选用β-actin，引物信息见表1。

表1 荧光定量引物信息Table 1 The information of fluorescent quantitative primer

1.3 组织RNA提取和cDNA合成

利用动物组织总RNA提取试剂盒(天根，北京)加Trizol(Invitrogen，美国)提取各组织总RNA，并用Nanodrop2000检测提取的RNA浓度和OD值，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。使用PrimerScriptTMRT Reagent Kit反转录试剂盒合成cDNA第一链，按照说明书进行操作。反转录产物稀释后，用内参基因β-actin进行PCR检测，检测合格后，-20 ℃保存。

1.4 实时荧光定量PCR(qPCR)

根据课题组前期设置的qPCR体系和程序[11-12]，建立和绘制目的基因及持家基因的标准曲线，检测引物扩增效率和熔解曲线状态，并进行qPCR反应以检测目的基因的相对表达量。

1.5 基因分型

对TSHR基因g.89290286A>G和g.89355312G>A位点在不同发情性状的绵羊品种中进行分型，采用SequenomMassARRAY○RSNP[13-14]技术对上述2个位点进行基因型检测。分型样品选择：小尾寒羊407只、滩羊22只、苏尼特羊21只、草原型藏羊161只、湖羊101只、策勒黑羊52只，其中小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊为常年发情品种，其它3个都是季节性发情品种。分型样品为DNA，每个样品需要量为20 μL，DNA浓度为40～80 ng/μL。

1.6 数据分析

根据2-ΔΔCt法[15]计算目的基因相对表达量；借助Microsoft Excel计算TSHR基因g.89290286A>G和g.89355312G>A位点的基因型频率、等位基因频率、多态信息含量(PIC)、杂合度(HE)及有效等位基因数(NE)，并进行Hardy-Weinberg检测。利用SPSS 19.0 软件中卡方独立性检验进行常年发情组和季节性发情组间基因频率与基因型频率差异显著性检验，所得数据用平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 TSHR基因在不同特征绵羊品种季节性发情相关组织中的表达

通过qPCR检测长光照下常年发情的小尾寒羊和季节性发情的苏尼特羊相关组织TSHR基因的表达，比较常年发情和季节性发情绵羊各组织TSHR基因的表达差异，结果如图1所示：TSHR基因主要在小尾寒羊和苏尼特羊下丘脑中表达，且无论小尾寒羊还是苏尼特羊，TSHR基因在下丘脑中表达量均极显著高于大脑和垂体(P<0.01)；苏尼特羊下丘脑组织TSHR表达量极显著高于小尾寒羊下丘脑组织(P<0.01)，大脑和垂体TSHR表达量在小尾寒羊和苏尼特羊之间均无显著差异(P>0.05)。

2.2 TSHR的多态性分析

通过基因分型发现TSHR基因g.89290286A>G和g.89355312G>A位点在常年发情和季节性发情绵羊品种中均存在三种基因型，分别是AA、GA和GG(见图2)。从表2可知，绵羊TSHR基因g.89290286A>G和g.89355312G>A位点的基因型频率在常年发情和季节性发情绵羊品种间差异均达到极显著水平(P<0.01)，而等位基因频率在常年发情和季节性发情绵羊品种间差异均未达到显著水平(P>0.05)，就g.89290286A>G位点而言，常年发情品种和季节性发情品种中AA均为优势基因型，A均为优势等位基因。

另外，分析了绵羊TSHR基因g.89290286A>G和g.89355312G>A位点在常年发情绵羊和季节性发情绵羊中的多态性，结果如表3所示。绵羊TSHR基因g.89290286A>G位点在小尾寒羊、策勒黑羊和草原型藏羊中表现为中度多态(0.25A位点在小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊中表现为中度多态(0.25

3 讨 论

3.1 TSHR基因表达与绵羊发情之间的关系

国外研究者通过全基因组重测序发现TSHR基因在鸡和绵羊中作为繁殖性状候选基因受到强烈选择[16-19]。目前的研究发现TSHR主要在甲状腺细胞表达[6,20]，并且在绵羊脑部的垂体结节部、正中隆起、室管膜室旁核和第三脑室等组织中均有表达[21-24]，这与本研究结果趋势一致，在本试验中发现TSHR主要在下丘脑组织中表达，推测下丘脑可能是绵羊TSHR基因发挥作用的主要部位，而下丘脑直接参与HPGA的生理调控过程。已有研究发现，在长光照下下丘脑中的TSHR与TSHβ相互作用后间接引起T3浓度的上升，高浓度的T3进而抑制绵羊的发情[25-28]。本研究结果显示，在长光照下，苏尼特羊下丘脑中TSHR基因表达量极显著高于小尾寒羊，推测苏尼特羊中高浓度的TSHR可能与更多的TSHβ结合，间接上调T3的分泌，高浓度的T3促使苏尼特羊进入休情状态。而小尾寒羊下丘脑中TSHR浓度相对较低，因此T3浓度相对较低，低浓度的T3可使小尾寒羊在长光照下依然保持发情状态。综上，提示我们TSHR基因的表达对于绵羊的季节性发情有一定的调控作用。

表2 TSHR基因g.89290286A>G和g.89355312G>A位点在常年发情和季节性发情绵羊品种中的基因型频率和等位基因频率Table 2 Genotype frequency and allele frequency of the locus of g.89290286A>G and g.89355312G>A of TSHRgene in year-round estrus and seasonal estrus

表3 TSHR基因g.89290286A>G和g.89355312G>A位点在不同绵羊品种中的群体遗传学分析Table 3 Population genetic analysis of the locus of g.89290286A>Gand g.89355312G>A ofTSHR gene in different breeds of sheep

注：P<0.05表示位点在该品种中未处于哈代温伯格平衡状态

Note: P<0.05 indicates that the locus is not in the Hardy-Weinberg equilibrium.

3.2 TSHR基因多态性及其与绵羊发情之间的关系

目前，关于绵羊TSHR基因的多态性及其与绵羊季节性发情之间关系的研究鲜有报道。绵羊TSHR基因g.89290286A>G和g.89355312G>A位点在6个绵羊品种中表现为中度多态或低度多态，说明上述6个品种的选择潜力不大，可能由于所选择的样本群体存在一定的局限性。TSHR基因2个位点在6个绵羊群体中均不处于哈代温伯格平衡状态，说明种群可能受到人工或自然选择、迁移和遗传漂变的影响，这2个位点在适应性方面不具有遗传优势。2个位点的基因型频率在常年发情和季节性发情绵羊品种间基本趋于一致，推测以上2个位点与绵羊的季节性发情存在一定关联。

4 结 论

本试验初步提示,TSHR基因表达可能与绵羊季节性发情有关，该基因表达水平较高时可能促进绵羊进入休情状态。g.89290286A>G和g.89355312G>A位点与绵羊季节性发情性状可能存在一定关联。