何家林，周杨杨，程 强，羿国娟，陈 勇，鲁 兰

(成都大学 四川抗菌素工业研究所，四川 成都 610052)

0 引 言

随着抗生素的滥用，细菌耐药性问题日益严重.铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，Pa)是外伤感染最常见致病菌，毒力强并易产生耐药性[1-2].细菌通过运动黏附在体内细胞发生定植，进而发生感染，和致病性息息相关，而细菌生物被膜的产生，可以阻止抗生素的进入，使产生生物被膜的菌株比浮游菌的耐药性提高100～1 000倍，是产生耐药性的重要途径，也是导致院内长期和反复感染的重要原因之一[3-8].目前，中药及天然产物在抗菌药物的研发领域越来越受到关注，成为发现新型抗菌药物的重要方向[9-10].然而，具有抗菌作用的中药在体内由于其吸收、分布和代谢过程，往往难以达到其直接抗菌的有效浓度，多数以亚抑菌浓度(Sub-Minimum inhibitory concentration，Sub-MIC)发挥其作用.Sub-MIC抗菌药物虽不能直接抑制细菌，但可影响细菌耐药、黏附与运动等生物学效应.四季青为冬青科植物冬青的干燥叶，性凉、味苦且微涩，功效为清热解毒、生肌敛疮及活血止血，临床上常以单味药材水煎液外用，治疗烧烫伤效果特佳[11-12].本研究以临床收集的常见致病菌株为对象，对四季青水煎液的抗菌活性进行评价，并对Sub-MIC四季青水煎液抑制铜绿假单胞菌运动和生物被膜形成的能力及消除生物被膜的量-效关系进行探讨，为四季青临床抗感染治疗提供了理论基础和参考.

1 材料与仪器

1.1 材 料

四季青叶(冬青科植物冬青Ilex chinensis Sims的干燥叶，经四川抗菌素工业研究所抗生素药效评价中心按中国药典2015版一部鉴别，经测定含原儿茶酸0.176%、绿原酸0.056%及槲皮素0.008%，对实验铜绿假单胞菌最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)为100 mg/mL)，购自广西亳州市君源堂药材站；临床分离致病菌株：金黄色葡萄球菌(MSSA)5株、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)5株、产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌(KE+)5株、大肠杆菌(KE-)5株、铜绿假单胞菌(Pa)5株，均由四川抗菌素工业研究所提供；质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 29213、大肠杆菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853，购自美国标准菌种收藏所(American type culture collection,ATCC)；MH(A)培养基(批号，20180602)，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；胰酪大豆琼脂培养基TSA(批号，7053894)，购自美国BD公司；胰蛋白胨(批号，201901-002)，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；酵母浸出粉，购自成都市科龙化工试剂厂；琼脂粉(批号，180201)，购自北京博奥拓达科技有限公司；营养肉汤NB(批号，201902-013)，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；美罗培南(批号，181003)，购自海口市制药厂有限公司；二甲基亚砜DMSO(批号，20130701)，购自成都市科龙化工试剂厂；氯化钠(批号，2019022101)，购自成都科隆化学品有限公司；生理盐水(批号，M0040806C)，购自四川科伦药业股份有限公司；25%戊二醛(批号，20181101)，购自成都市科龙化工试剂厂；结晶紫(批号，602w041)，购自北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇(批号，2018051301)，购自成都市科龙化工试剂厂；无菌96孔板(批号，010617A005，规格，12×8孔)，购自NEST公司；麦氏比浊管(批号，075870)，购自广东环凯微生物科技有限公司.

1.2 仪 器

Multiskan FC型酶标仪(赛默飞世尔上海仪器有限公司)，ZHWY-100B恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)，GNP-9080隔水式恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)，Sartorius BS124S型电子天平(德国Sartorius公司).

2 方法与结果

2.1 溶液与平板制备

2.1.1 四季青水煎液制备

称取干燥四季青叶30 g，用洁净纱布包好置于砂锅内，加蒸馏水500 mL，浸泡30 min，武火100 ℃煎煮15 min，转文火100 ℃继续煎煮30 min，倒出药液(约50 mL)，再加500 mL蒸馏水.按上述方法煎制，将2次药液(约100 mL)合并后100 ℃浓缩30 min至10 mL，其浓度相当于生药量3 000 mg/mL，现配现用.

2.1.2 培养平板与培养液制备

TSA平板：称取TSA培养基4 g，加蒸馏水100 mL,使其溶解后，121 ℃高压灭菌30 min，备用.

LB培养基：胰蛋白胨4 g，酵母浸出粉2 g，氯化钠4 g，加蒸馏水400 mL，调pH值至7.0，121 ℃高压灭菌30 min，备用.

浮泳运动培养基：称胰蛋白胨3 g，氯化钠3 g，琼脂1.5 g，加300 mL蒸馏水，搅匀，121 ℃高压灭菌30 min，50 ℃水浴保温备用.

蹭行运动培养基：称胰蛋白胨3 g，酵母浸出粉1.5 g，氯化钠3 g，琼脂3 g，加300 mL蒸馏水，搅匀，121 ℃高压灭菌30 min，50 ℃水浴保温备用.

营养肉汤培养基：称取营养肉汤NB培养基1.8 g，加蒸馏水100 mL，121 ℃高压灭菌30 min，备用.

2.2 四季青水煎液的体外抗菌活性

采用美国临床实验室标准化委员会(Clinical and laboratory standards institute,CLSI)琼脂二倍稀释法进行MIC测定.取3 000 mg/mL四季青水煎液，按二倍稀释法使其在3 000～46.87 mg/mL范围内.实验同时设置美罗培南阳性对照组和菌液对照组进行质控.

无菌平皿内分别加入不同浓度四季青水煎液各1 mL，再加入融化的50 ℃ MH(A)培养基14 mL，混匀，按二倍稀释法使每平皿内所含药物浓度依次为200、100、50.0、25.0、12.5、6.25、3.12 mg/mL，待冷却后用多点接种仪分别接种不同菌液，菌液浓度为106CFU/mL，于35 ℃ 培养18～20 h，平皿内未见细菌生长的最低药物浓度(即最低抑菌浓度MIC).结果表明，四季青叶水煎液对金黄色葡萄球菌MSSA和MRSA的抗菌活性最强，均为6.25 mg/mL，而对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抗菌活性相对较弱，如表1所示.由此可见，四季青抗铜绿假单胞菌的MIC值较大，由于药物的吸收代谢等过程，在体内难以达到MIC值，基本是以Sub-MIC存在，所以难以发挥直接的抗菌作用.因此，有必要研究其Sub-MIC对铜绿假单胞菌其他方面的影响.

表1 四季青水煎液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的MICR(n=5)

2.3 Sub-MIC四季青水煎液对铜绿假单胞菌运动能力的影响

2.3.1 浮泳运动

取铜绿假单胞菌于TSA平板上复苏过夜，挑取单个菌落溶于无菌生理盐水，调至5.0麦氏比浊度，用LB培养基稀释10倍后于37 ℃恒温静置培养20 h，备用.用浮泳运动培养基和四季青水煎液混合，按二倍稀释法分别制成含药量为100、50.0、25.0、12.5、6.25 mg/mL(相当于1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC)的浮泳运动平板，同时制备空白对照.取上述静置培养20 h后的铜绿假单胞菌培养液1 μL接种于培养基的表面，37 ℃正置培养18 h，用游标卡尺测定其生长直径.

四季青水煎液对铜绿假单胞菌浮泳运动的抑制能力如表2与图1所示.在四季青水煎液浓度为50 mg/mL和25 mg/mL(1/2×MIC和1/4×MIC)时，其菌落生长直径与空白对照组比较有显著性差异(P<0.01)，对细菌浮泳运动有较好的抑制作用.

表2 Sub-MIC四季青水煎液对铜绿假单胞菌浮泳运动的影响(n=6)

2.3.2 蹭行运动

取铜绿假单胞菌于TSA平板上复苏过夜，挑取单个菌落溶于无菌生理盐水，调至5.0麦氏比浊度，用LB培养基稀释10倍后于37 ℃恒温静置培养20 h，备用.用蹭行运动培养基和四季青水煎液混合，按二倍稀释法分别制成含药量为100、50.0、25.0、12.5、6.25 mg/mL(相当于1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC)的蹭行运动平板，同时制备空白对照.取上述静置培养20 h后的铜绿假单胞菌培养液1 μL接种于培养基底部与培养皿接触的地方，37 ℃正置培养18 h，游标卡尺测定其生长直径.

四季青水煎液对铜绿假单胞菌蹭行运动的抑制能力如表3与图2所示.在四季青水煎液浓度为50 mg/mL和25 mg/mL(1/2×MIC和1/4×MIC)时，其菌落生长直径与空白对照组比较有显著性差异(P<0.01)，对细菌蹭行运动有较好的抑制作用.

表3 Sub-MIC四季青水煎液对铜绿假单胞菌蹭行运动的影响(n=6)

2.4 Sub-MIC四季青水煎液对铜绿假单胞菌生物被膜的作用

取铜绿假单胞菌于TSA平板上复苏过夜，挑取单个菌落溶于无菌生理盐水，调至1.0麦氏比浊度，用营养肉汤稀释20倍后备用.

取1套96孔板，于第2～10列，每列第2行起6个复孔中，分别加入备用的菌液200 μL，置37 ℃恒温培养3 d 后取出，倒掉剩余培养液，用无菌生理盐水小心洗涤2次；于第2～9列中分别加入四季青水煎液浓度为100、50.0、25.0、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78 mg/mL(分别相当于1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC、1/32×MIC、1/64×MIC、1/128×MIC)的营养肉汤液200 μL；第10列为不含四季青水煎液的空白对照，每列6个复孔，其余孔中分别加入无菌生理盐水200 μL，置37 ℃恒温培养72 h后取出，用无菌生理盐水小心洗涤2次，加入2.5%戊二醛280 μL后固定20 min，用生理盐水洗涤2次，加入2%结晶紫溶液280 μL染色10 min，再用无菌生理盐水缓慢洗去多余结晶紫，加入200 μL无水乙醇溶解，酶标仪测定570 nm处OD值.

四季青水煎液对铜绿假单胞菌生物被膜72 h的消除作用如表4与图3所示.四季青水煎液在浓度为100、50.0、25.0、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78 mg/mL(分别相当于1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC、1/32×MIC、1/64×MIC、1/128×MIC)时，与空白对照组比较，在100～6.25 mg/mL(1～1/16MIC)浓度范围，各组均有显著性差异(P<0.05或P<0.01).

2.5 Sub-MIC四季青水煎液消除铜绿假单胞菌生物被膜作用的量-效关系

根据四季青水煎液对铜绿假单胞菌生物被膜消除的有效剂量(1×MIC～1/16×MIC)和消除率，采用PKSolver 2.0软件SigmodEmaxPD模型，分别用2种基本S曲线模型对有效实验数据进行拟合，获得相关参数为：SigmoidEmaxModel(模型1)AIC值为33.84，R2值为0.97；SigmoidEmaxModel withE0(模型2)AIC值为31.12，R2值为0.99.根据拟合优度，选择SigmoidEmaxModel withE0(模型2)进行拟合，结果如表5、表6和图4所示.其中，Emax为52.20%，EC50为7.02 mg/mL，E0为12.69%，拟合式为，

(1)

表5 Sub-MIC四季青水煎液对铜绿假单胞菌生物被膜消除率

表6 Sub-MIC四季青水煎液消除生物被膜作用的PD参数

3 讨 论

四季青水煎液在1×MIC浓度时，浮泳运动和蹭行运动平板中均未见菌落生长，这与在该浓度下四季青水煎液已经能完全抑制细菌的生长一致.四季青水煎液在1/2×MIC的Sub-MIC下，浮泳运动和蹭行运动平板中虽然有菌群生长，但菌群生长直径较空白对照组比较均有明显减小(P<0.05或P<0.01)，表明在此Sub-MIC下四季青水煎液虽未对铜绿假单胞菌的生长产生明显的抑制作用，但能使铜绿假单胞菌的运动能力受到明显抑制.由于细菌的扩散力和侵袭力主要是由细菌的鞭毛运动产生，其受到抑制时将直接影响细菌的定植，进而影响到生物被膜形成过程中细菌的黏附和生物被膜的形成[13-14].四季青水煎液对铜绿假单胞菌生物被膜在72 h时具有较强的消除作用，但由于该项操作是在已经生成的生物被膜中加入四季青水煎液后进行的，而中途也需要更换新鲜的培养液，导致短时间(0～24 h)内残留的细菌得以继续产生生物被膜，直至24 h时生物被膜生成量才开始下降，因此，为克服细菌生物被膜自身生长规律的影响，本实验选择24 h时生物被膜OD值作为基准，以24 h为起点开始观察，并获得相应的Emax、EC50、E0及γ等参数.实验结果表明，四季青水煎液在1×MIC～1/16×MIC下能消除已生成的生物被膜并具有一定的量-效关系.综上所示，四季青在Sub-MIC下能抑制铜绿假单胞菌的运动能力和生物被膜的生成，从而降低细菌的致病性和耐药性，能够被人体正常免疫系统清除，从而达到治疗感染的效果，这与中药主治未病且以调理为主的理论相吻合.四季青在Sub-MIC消除生物被膜的量-效关系也为其治疗临床感染的剂量选择提供了理论依据.