吴 鹏，史 锐，邹长鑫，刘苗苗

(辽宁中医药大学 药学院，辽宁 沈阳 110000)

黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa)，又称野樱莓、不老莓，属于蔷薇科腺肋花楸属植物，果实为紫黑色圆形小浆果，富含蛋白质、糖类、有机酸、微量元素、多酚类化合物等，其中黄酮，花青素、原花青素和酚酸等多酚类物质发挥着最主要的生理活性[1]，具有极强的清除自由基的能力，此外还可以调节免疫系统，有效预防和治疗糖尿病、动脉粥样硬化等[2-3]。

绿原酸属于酚类化合物，具有抗菌、抗病毒、保肝利胆等多种药理作用[4]，被称为第七大营养素[5]。因绿原酸所具有的独特生物活性，其已经广泛应用于医药、食品等领域[6-7]。但国内对黑果腺肋花楸中绿原酸含量的相关研究较少，且关于其含量测定方法的介绍并不详细。本实验采用超声法提取黑果腺肋花楸果实中的绿原酸，并在料液比、乙醇体积分数、提取时间、提取温度单因素实验的基础上，采用正交试验优化其提取工艺，为黑果腺肋花楸果实的开发利用奠定基础。

1 材料与仪器

黑果腺肋花楸果实(辽宁华嵿农业科技有限公司)；绿原酸标准品(北京索莱宝试剂有限公司)；甲醇、无水乙醇、盐酸均为国产分析纯。

UV5100紫外可见-分光光度计；KQ5200DB型数控超声波清洗器；精密分析天平；FW100高速万能粉碎机；电热恒温鼓风干燥箱。

2 实验方法

2.1 原料前处理

于-80 ℃冰箱中取出黑果腺肋花楸果实，蒸馏水解冻过夜，45 ℃烘干，打粉过五号筛备用。

2.2 黑果腺肋花楸果实中绿原酸样品制备

精密称取黑果腺肋花楸果实粗粉1 g，精密加入25 mL 60%乙醇-盐酸溶液，称重，45 ℃条件下超声提取60 min，放冷，加相应溶剂补足重量，摇匀抽滤，得待测样品粗提液。

2.3 黑果腺肋花楸果实中绿原酸含量测定

2.3.1 波长扫描 精密吸取一定量待测样品提取液，采用紫外分光光度计在200～800 nm范围内进行全波长扫描，确定绿原酸的最大吸收波长为297 nm。

2.3.2 绿原酸标准曲线绘制精密称取绿原酸标准品0.003 g，采用甲醇-盐酸溶液定容至100 mL容量瓶中，分别精密吸取0、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30、0.36、0.42 mL母液定容至10 mL容量瓶。在波长297 nm处测定不同浓度标准品的吸光度(A)值，以绿原酸质量浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2.3.3 绿原酸含量测定 移液枪吸取一定量待测液，用对应溶剂定容至10 mL容量瓶，在297 nm处测定待测液吸光度，根据回归方程求出提取液中的绿原酸质量浓度(μg/mL)。

2.3.4 绿原酸提取率计算

绿原酸提取率=(V·C·D×10-6)/M×100%

(1)

式中V：提取液定容体积，mL；C：标曲求得绿原酸浓度，μg/mL；D：提取液稀释倍数；M：黑果腺肋花楸果实样品质量，g。

2.4 黑果腺肋花楸果实中绿原酸提取率的单因素考察

精密称取1.0 g黑果腺肋花楸果实粉末，对提取溶剂、乙醇分数、提取温度、提取时间、料液比进行考察，按照“2.3.3”“2.3.4”项下方法计算绿原酸含量及提取率，确定最佳提取条件。

3 结果与分析

3.1 绿原酸标准曲线建立

线性回归方程为y=0.08x-0.011(r=0.999 6)，其中x为绿原酸质量浓度，y为吸光度值，由图1可知绿原酸在1.8～12.6 μg/mL质量浓度范围内与其吸光度值具有良好的线性关系。

图1绿原酸标准曲线

3.2 单因素对黑果腺肋花楸果实中绿原酸提取率的影响

3.2.1 溶剂对绿原酸提取率的影响图2显示，与水提法相比，乙醇提取法对黑果腺肋花楸果实中绿原酸提取率影响显著，绿原酸提取率从0.448%提高到0.592%。这是由于绿原酸在酸性介质中表现出较强的稳定性，然而酸性过高会导致其他杂质有机盐被酸化溶出，故本实验在2种溶剂中分别加入0.2 mol/L盐酸溶液。此外，初期对不同体积分数的乙醇溶剂进行比较，发现不同体积分数的乙醇对绿原酸提取率较大影响。因此需要进一步对不同乙醇体积分数进行考察。

图2不同提取溶剂对绿原酸得率的影响

3.2.2 乙醇体积分数对绿原酸提取率的影响 图3显示，乙醇体积分数越高，绿原酸提取率越高，在乙醇体积分数为60%时，绿原酸提取率达到最大，为0.938%，而后出现下降现象。这是由于绿原酸的极性偏大，高浓度的乙醇不易使其溶解，致使过多脂溶性杂质溶出，影响绿原酸提取率。

图3乙醇体积分数对绿原酸提取率的影响

3.2.3 料液比对黑果腺肋花楸果实中绿原酸提取率的影响 图4显示，随着料液比的增加，绿原酸提取率逐渐从0.837%提高至0.908%，在1∶45(g/mL)达到最大，而后随着料液比的增加，绿原酸提取率下降至0.769%。这是由于在一定范围内溶剂越多，样品与原料接触更充分，传质作用越强，绿原酸提取率增大，但溶剂过多会致使醇溶性蛋白等杂质溶出，影响绿原酸提取率。

3.2.4 提取温度对绿原酸提取率的影响图5显示，随着温度的升高，绿原酸提取率逐渐升高，在55 ℃时达到最大，为1.064%。当温度达到60 ℃时，绿原酸提取率有所下降。因这是由于温度升高会发生分子的热运动现象，分子的动能增加，可促进分子运动与物质交换。但温度过高会致使绿原酸部分分解，影响绿原酸提取率。

图4料液比对绿原酸提取率的影响

图5提取温度对绿原酸提取率的影响

3.2.5 提取时间对绿原酸提取率的影响图6显示，随着提取时间的延长，黑果腺肋花楸果实中绿原酸提取率从0.890%逐渐提高到0.981%，但提取时间达到75 min后，提取率有所下降。这是由于超声时间短，绿原酸未完全溶出，而超声时间过长，脂溶性杂质溶出增多，可吸附些许绿原酸，此外还可能发生热效应，致使部分绿原酸分解，影响提取率。

图6提取时间对绿原酸提取率的影响

3.3 黑果腺肋花楸果实中绿原酸提取工艺条件的优化

3.3.1 提取各因素水平的建立 根据单因素试验结果，确定乙醇浓度、温度、料液比及超声时间为主要的影响因素，每个因素设置3个水平。以黑果腺肋花楸绿原酸提取率为指标，采用L9(34)正交试验筛选最佳的提取工艺，设计的正交试验各因素水平范围见表1。

表1 正交试验各因素水平设计

3.3.2 正交试验结果与分析 按照上述设计的因素水平依次进行测定，结果见表2。

表2 正交试验设计及结果

正交试验结果表中R值显示，影响黑果腺肋花楸果实中绿原酸提取率的因素顺序为乙醇分数>提取温度>提取时间>料液比。K值显示，提取最优组合为A2B1C1D2，即乙醇分数60%，料液比1∶40(g/mL)，提取温度55 ℃，提取时间60 min。进行3次验证性实验，测得绿原酸平均含量为12.13 mg/g，平均提取率为1.187%，RSD为0.07%，与正交表内结果相比，可确定此工艺为最优提取工艺，且重复性好，稳定性高。

4 结论

本实验确定的黑果腺肋花楸果实中绿原酸的最佳提取工艺为乙醇分数60%，料液比1∶40(g/mL)，提取温度55 ℃，提取时间60 min，在此提取工艺下进行3次验证性实验，测得绿原酸平均含量为12.13 mg/g，平均提取率为1.187%，相较王鹏等[8]报道的绿原酸含量有明显升高。本研究结果表明，以60%乙醇加酸性介质为溶剂，运用超声法提取能有效提高黑果腺肋花楸果实中绿原酸的提取率，为黑果腺肋花楸的进一步研究与开发奠定了基础。