郝曜山 王晓清 张欢欢 王亦学 孙 毅 段永红 杜建中 周福平

(1山西省农业科学院高粱研究所高粱遗传与种质创新山西省重点实验室，山西 晋中 030600；2山西省农业科学院生物技术研究中心，山西 太原 030031；3山西农业大学农学院，山西 太谷 030801)

高粱[Sorghum bicolor(L.) Moench]是世界上重要的粮食、饲料和酿酒原料，因其本身具有抗旱耐涝、耐盐碱、耐贫瘠等特性，一直是旱作农田的先锋作物[1]。长久以来，草害一直是造成高粱产量、品质下降的重要因素之一[2]。由于高粱是一种对除草剂敏感性较强的作物，除草剂使用不当，极易对高梁产生药害[3]。因此，要解决现代农业的规模化、机械化快速发展及粱农村劳动力缩减等问题的矛盾，必须选育抗除草剂高粱，并配合田间化学防治杂草的技术[2]。现代植物基因工程可以直接将抗除草剂的功能基因导入高梁，有效克服高粱传统育种中有性杂交不亲和及抗除草剂种质资源匮乏等弊端，为高粱抗除草剂遗传改良提供新的途径[4]。

目前，常用的高粱基因转化方法有5种:农杆菌介导法、基因枪法、PEG 法、电激法和花粉管通道法[5]。其中，前4种方法均依赖于植物高频率组织培养再生体系或原生质体培养体系的建立。近些年通过组织培养进行高粱遗传转化的报道逐渐增多，Zhao 等[6]首次利用农杆菌介导法，以高粱幼胚作为受体材料，导入外源基因bar获得了转基因植株；朱莉等[7]以甜高粱幼穗愈伤组织为转化受体，通过农杆菌介导法将Bt cry1Ah基因成功导入到2个甜高粱品种BABUSH和MN-3025 中；Lu 等[8]和Wu 等[9]分别建立了高粱高效的遗传转化体系并分别获得了高达20.7%和33%的遗传转化率。但这些成果仍然集中在少数模式材料(Tx430、P898012[10]及一些甜高粱品种)中。与其他重要禾本科作物相比，高粱依然被认为是再生体系最难建立、基因转化最困难的作物之一。此外，采用花粉管通道法进行高粱转基因，虽然不经过组织培养，但其存在操作难度大、转化率低、可重复性差等缺点，较前4种方法应用较少。

本研究拟对萌动的高粱种子进行农杆菌侵染、愈伤组织诱导，以及基因转化因素的优化与分析。将中国农业科学院作物科学研究所玉米分子遗传改良实验室保存构建的土壤农杆菌CP4株系携带抗除草剂目的基因5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，CP4-EPSPS)的载体pM3301UbiSpCP4 导入高粱Is-623 中，以期获得耐草甘膦高粱新品系，丰富转基因高粱耐除草剂材料，尝试建立以高粱萌动的成熟种子为外植体的基因转化体系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 受体材料 选用高粱材料Is-623 成熟种子为待处理转化材料(由山西省农业科学院高粱研究所保存)。

1.1.2 菌株与质粒 农杆菌菌株为LBA4404，由中国农业科学院作物科学研究所玉米分子遗传改良实验室构建保存，内含pM3301UbiSpCP4 质粒，携带目的基因CP4-EPSPS，全长10 293 bp，该菌株产物对除草剂草甘膦具有很强抗性(图1)。质粒目的基因CP4-EPSPS受组成型强启动子——玉米泛素启动子pZmUbi-1 启动表达和NOS 终止子调控，该基因既可作为目的基因，又可作为筛选标记。

图1 pM3301UbiSpCP4质粒载体Fig.1 The structure of the pM3301UbiSpCP4 plasmid

1.1.3 培养基配方 1)侵染培养基:MS+1 g·L-1水解酪蛋白氨基酸、5 mg·L-1麦草畏(dicamba)[11]、65 g·L-1蔗糖、30 g·L-1葡萄糖；

2)共培养基:MS+5 mg·L-1麦草畏、20 g·L-1蔗糖、10 g·L-1葡萄糖、500 mg·L-12-(N-吗非啉)乙磺酸[2-(n-murphyline) ethanesulfonic acid，MES]、8 g·L-1琼脂(agar)，100 μmol·L-1高压灭菌后加入乙酰丁香酮(acetosyringone)；

3)愈伤组织诱导培养基:MS+5 m·L-1麦草畏、20 g·L-1蔗糖、1.53 g·L-1磷酸二氢钾(KH2PO4)、2.4 g·L-1植物凝胶(gelrite)、5 mg·L-1硝酸银(AgNO3)、100 mg·L-1酸水解酪蛋白氨基酸(N-Z-Amine)、10 mg·L-1草甘膦(glyphosate)、250 mg·L-1头孢噻肟钠(cefotaxime)；

4)筛选培养基:MS+5 m·L-1麦草畏、20 g·L-1蔗糖、1.53 g·L-1KH2PO4、2.4 g·L-1植物凝胶(gelrite)、5 mg·L-1硝酸银、100 mg·L-1N-Z-Amine、10 mg·L-1草甘膦、250 mg·L-1cefotaxime；

5)再生培养基:MS+0.5 mg·L-1KT、20 g·L-1蔗糖、1.53 g·L-1KH2PO4、2.4 g·L-1gelrite、25 mg·L-1草甘膦、250 mg·L-1cefotaxime；

6)生根培养基:1/2MS+20 g·L-1蔗糖、2.4 g·L-1Gelrite、250 mg·L-1cefotaxime。

以上所有培养基pH值均为5.8，121℃高压灭菌20 min，备用，其中乙酰丁香酮、AgNO3、头孢噻肟钠和酸水解酪蛋白氨基酸在灭菌后温度降至60℃左右时于超净工作台加入。以上试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

培养室温度为27±3℃，光周期条件为光16 h/暗8 h，光照强度为2 000～5 000 lx[12]，其中共培养为暗培养。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的准备 挑选成熟饱满高粱种子，用自来水冲洗除去表面杂质，无菌条件下75%酒精消毒1 min，然后用30%双氧水消毒1.5～3.0 h。处理后的种子用无菌水冲洗6 遍，然后置于装有无菌水的组培瓶中，置于25℃条件下培养24 h，待其萌动露白后备用。

1.2.2 农杆菌的活化与外植体的侵染、转化、筛选、再生 将含有质粒pM3301UbiSpCP4的农杆菌菌株LBA4404 在冰中融化，接种于YEP 液体培养基中[含100 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡那霉素(kanamycin)]，调节摇床于28℃、220 r·min-1培养过夜。菌液OD600值为0.6～0.8时，将菌液离心(8 000 r·min-1)，收集沉淀，用侵染培养基悬浮制作侵染液(OD600=0.8)，加入乙酰丁香酮后于28℃混匀，待用。

将萌动露白的高粱种子放到含侵染液的试管中，最大速度涡旋10 s，然后室温静止5 min，弃去侵染液，用无菌滤纸吸干残留的侵染液后接于共培养基中，25℃条件下暗培养3 d。

将萌动种胚转到愈伤组织诱导培养基上，28℃暗培养10～12 d；将愈伤转到筛选培养基上，28℃暗培养14 d，可继代培养；将筛选后存活的胚性愈伤组织转移到再生培养基上，26℃光照条件下培养10～12 d。转移全部的已分化的植株到生根培养基上，26～28℃光照条件下培养至生根。

1.2.3 麦草畏对高粱成熟萌动胚愈伤组织诱导的影响 采用麦草畏作为高粱愈伤组织诱导激素。将萌动露白的高粱种子分别放入含有1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mg·L-1麦草畏的愈伤组织诱导培养基上，28℃暗培养10～12 d 后统计愈伤组织诱导率:

愈伤组织诱导率=诱导出愈伤组织的外植体/接种外植体(萌动露白的高粱种子)总数×100%。

1.2.4 侵染时间对高粱愈伤组织转化效率的影响 预备试验中将灭菌处理后萌动露白的高粱种子放在OD600值为0.6～0.8的侵染液中分别侵染0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h 后，共培养3 d，然后转至愈伤组织诱导培养基上，28℃暗培养10～12 d。每个处理挑选健康生长的愈伤组织30 块，重复3次，转到筛选培养基上，28℃暗培养14 d，统计抗性愈伤的比率。

1.2.5 转化株的PCR检测 取愈伤组织再生的高粱抗性植株(T0)与对照(CK)叶片0.2 g，CTAB 法提取总DNA。用引物CP4-F:5′-CGCGATCATACGGAAAAG AT -3′，CP4-R:5′-GTGACAGGGTTTTCCGACAC-3′扩增导入的目的基因CP4-EPSPS，该引物扩增片段条带大小为668 bp。扩增程序:94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，32个循环；72℃再延伸5 min。PCR 扩增产物用1.0%电泳分离，并观察拍照[13]。

1.2.6 转化植株的Southern blotting 分析 取PCR 阳性的转化株(T0)叶片1 g，CTAB 法提取高粱总基因组DNA，用HindⅢ与EcoRⅠ限制性内切酶双酶切后，将酶切产物于1%琼脂糖凝胶上电泳分离。DNA 探针选用CP4-EPSPS基因大小为668 bp片段，Southern blot试剂盒为瑞士Roche 公司的DIG DNALabling and Detection Kit。具体试验方法参照《分子克隆实验指南》[14]，杂交后用X-光片显影曝光。

1.2.7 转基因高粱CP4-EPSPS基因表达产物的测定 取Southern blotting 分析阳性转化株(T0)和对照叶片约0.2 g，采用CP4 快速检测试纸条(北京奥创金标生物技术公司)检测目标基因蛋白表达。

1.2.8 转基因高粱耐草甘膦性能的鉴定 T0经分子检测的转基因高粱株系于6月初移栽，待叶片长至四至五叶期，采用20 mmol·L-1草甘膦溶液进行喷施，10 d 后进行草甘膦抗性鉴定并统计分析。根据具体情况参考GB/T 17980.42-2000[15]对T0高粱抗草甘膦性能进行分级，分级标准如下:

等级1:施药后植株无任何药害，生长健壮正常；

等级2:施药后轻微药害，叶片药害少于10%，生长健壮正常；

等级3:施药后植株萎焉、药害后可恢复，中等药害，基本不影响产量；

等级4:施药后药害较重，难以恢复，造成减产；

等级5:被施药后药害严重，萎焉枯萎，绝产或死亡。

2 结果与分析

2.1 转CP4-EPSPS基因高粱植株的获得

生长良好的高粱成熟种子萌动胚经农杆菌侵染共培养后诱导愈伤组织，转移到愈伤组织诱导培养基上，暗培养10～12 d 后转入含25 mg·L-1草甘膦筛选培养基，28℃暗培养14 d，进行3 轮继代筛选，大部分愈伤组织生长缓慢，褐变腐死，少部分生长旺盛、颜色鲜嫩。经筛选共获得301 块抗性愈伤组织，经过再生培养、生根培养、缓苗状苗后，移栽到温室(图2)。最终共获得75株成活苗、19株PCR 阳性植株及17株Southern blotting 检测阳性植株。以获得的抗性愈伤组织为分母，计算得到平均转化率为5.6%。

2.2 麦草畏对高粱成熟萌动胚愈伤组织诱导的影响

由图3可知，随着培养基中麦草畏浓度的升高，外植体愈伤诱导率快速升高，当麦草畏浓度为5 mg·L-1时，外植体愈伤诱导率达到最高；麦草畏浓度超过7.5 mg·L-1时，外植体愈伤诱导率明显下降；当麦草畏浓度为15 mg·L-1时，外植体愈伤诱诱导率几乎为零，且麦草畏对高粱萌动种子达到半致死剂量。综上，麦草畏对高粱成熟萌动胚愈伤组织适宜诱导浓度约为5 mg·L-1。

2.3 农杆菌侵染时间对高粱遗传转化效率的影响

由图4可知，随着侵染时间的逐渐延长，高粱遗传转化效率先升高后趋于稳定。当侵染时间为2 h时，高粱遗传转化效率达到最高。考虑试验效率，选择2 h作为农杆菌适宜的侵染时间。

2.4 转基因植株的PCR 分析

PCR检测结果表明，有19株再生高粱和阳性对照(质粒DNA)均扩增出大小相同，长度为668 bp的目标条带，水空白对照(CK2)和非转基因原受体高粱的负对照(CK1)均未扩增出目标条带(图5)，初步证明外源基因CP4-EPSPS已导入受体高粱的基因组DNA 中。在75株成活苗中，仅有19株PCR检测成阳性，说明经筛选培养基筛选并再生的植株中有74%为假阳性苗。

图2 转CP4-EPSPS基因高粱植株的获得Fig.2 Acquirement of transgenic CP4-EPSPS sorghum

2.5 转基因植株Southern blotting 分析

为了进一步研究CP4-EPSPS基因是否整合到高粱基因组DNA 中，对19株PCR检测呈阳性的植株进行Southern blotting 杂交分子检测。转化株基因组DNA 经Hind Ⅲ与Sal 酶双切后，质粒CK+和目的基因探针杂交后有17株显示了特异的阳性条带(图6)，而未转化的阴性对照植株(图6，泳道N)无杂交信号，结果初步证实CP4-EPSPS基因已整合到高粱基因组DNA 中。其中转化材料10 出现了双条或多条杂交带，证明部分材料外源基因以多拷贝的形式整合到了受体高粱材料的基因组中。

2.6 转基因高粱CP4-EPSPS基因表达产物的测定

将Southern blotting 杂交分子检测筛选鉴定后的转基因阳性植株17株及阴性对照植株，分别利用北京奥创金标生物技术公司生产的CP4-EPSPS 蛋白检测试纸条检测，其中试纸条检测为阳性(两条带)的有12株，有5株转化株和阴性对照植株(CK-1)同表现为阴性。部分抗草甘膦蛋白免疫试纸条检测结果见图7，3、6、7、8、10、11、13、16、18、20、25 转化株CP4-EPSPS基因表达蛋白检测为阳性，19 转化株Southern blotting检测结果为阳性，但其基因表达蛋白检测结果与非转基因对照检测结果均为阴性。

图3 麦草畏浓度对高粱成熟萌动胚愈伤组织诱导率的影响Fig.3 Effect of dicamba concentration on callus induction rate of sorghum mature germinating embryos

图4 不同侵染时间对高粱遗传转化效率的影响Fig.4 Effect of different infection time on transformation efficiency of sorghum

图5 转基因高粱CP4-EPSPS基因PCR检测Fig.5 PCR analysis of transformed sorghum plants(CP4-EPSPS gene)

2.7 转基因高粱耐草甘膦性能的鉴定

T0转基因植株(成苗75株)和对照植株喷雾除草剂的初步调查显示，抗性等级1级株系有6株，抗性等级2级株系有3株，抗性等级3级株系有2株，抗性等级4级株系有1株，抗性等级5级株系有63株(表1)，其田间表现状况与CP4-EPSPS 蛋白检测试纸条检测结果一致。其余分子检测为阴性的株系与对照植株在草甘膦喷雾25 d 后全部死亡，抗性等级也为5级，田间抗性检测结果与分子检测结果一致，证明导入和表达CP4-EPSPS基因可以提高转基因植株的草甘膦耐性。

3 讨论

众所周知，高粱是外源基因导入最难的禾本科作物之一，其愈伤组织诱导和再生受诸多因素影响，如外植体的选择、激素配比、基因型等都是决定遗传转化再生成功的重要因素[16-18]。林凤等[19]、张明洲等[20]及石太渊等[21]在使用高粱茎尖、幼穗和幼胚等作为外植体培养诱导再生高粱的试验中，都得出幼穗和幼胚作为外植体是诱导率和分化率最高的结论。而王栋等[22]和赵利铭等[23]研究表明，使用高粱成熟种子作外植体，加以相关培养基配方调整也可以获得较高的愈伤诱导率和组织分化率。本研究以刚露白的成熟高粱种子为外植体，首次以麦草畏取代常用的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D)、6-苄氨基嘌呤[N-(phenylmethyl)-9H-purin-6-amine，6-BA]等激素，同样获得了较高的愈伤诱导率(85%以上)，达到甚至超过了以高粱幼胚为外植体的愈伤诱导率，但组织分化率水平一般，褐化较严重，这可能与试验所用材料的基因型有关，具体原因有待进一步探究。尽管如此，利用萌动后的高粱种子作为外植体，避免了幼胚及幼穗作外植体取材受季节限制的缺点，也避免了成熟胚作外植体要剥胚[24]的繁琐操作，极大地提高了高粱遗传转化的效率。

目前关于受体材料选择、预培养时间、乙酰丁香酮浓度、侵染时间和侵染液浓度、共培养时间等转化条件对高粱基因转化的影响均已有详细的研究报道[4，6，25]。本研究以高粱萌动胚作为侵染对象，结果表明，侵染时间为0.5～2 h时，侵染时间越长，所获得的抗性愈伤组织率越多，但侵染时间继续延长至5 h，所获得的抗性愈伤组织率保持在稳定水平，这与彭亚博等[12]和张微等[4]的研究结果不同，可能与采用的外植体不同有关，与幼胚相比，露白的种子被农杆菌菌液侵染时具有更强的耐受力，具体原因有待进一步研究。

表1 转基因高粱耐草甘膦性能的鉴定及计数Table1 Identification and counting of glyphosate tolerance of transgenic sorghum

图6 部分转基因高粱植株Southern blotting 分析结果Fig.6 Part of transformed sorghum plants identified by Southern blotting

图7 部分转基因高粱植株抗草甘膦蛋白免疫试纸条检测结果Fig.7 Detection results about part of transformed sorghum plants by glyphosate protein immunoassay strip

CP4-EPSPS基因能否整合到转化受体DNA，能否正确表达及表达水平的高低决定着所获得的转基因高粱对草甘膦的耐性程度[26-28]，也决定着转基因高粱遗传转化成功与否及其应用价值。杨慧珍等[29]在转草甘膦玉米的ELISA 检测和田间抗性鉴定时发现，所获得的10个转化事件中，高耐株系有4个，耐性株系有5个，低耐株系有1个，不同转化事件中目的基因的拷贝数、表达量与其植株的除草剂耐性值的差异有关。本研究也发现了类似现象，转CP4-EPSPS基因高粱植株的草甘膦耐性在不同转化事件中存在差异[30]。如抗性等级4级的株苗(编号为10的转化材料)的Southern blotting 杂交分析结果为多拷贝阳性苗，田间草甘膦耐性较低，未能完成正常的生长周期。编号为18的转化材料虽经Southern blotting 杂交分析检测与编号7 等材料同为单拷贝，但田间草甘膦耐性仅为3级，试纸条基因表达显示条带较弱，显示外源基因在受体中表达，不仅与转化拷贝数有关，也与插入植物DNA位点的表达调控有关[28，31]。此外，转基因高粱的遗传稳定性对转基因高粱品种的选育至关重要，继续对所获转化材料的后代进行田间鉴定和分子检测，直至获得外源基因纯合稳定遗传的高代转基因系，将是下一步深入开展的工作。

4 结论

本研究利用农杆菌介导高粱萌动种子诱导愈伤进行遗传转化，初步建立了一套以高粱萌动露白种子为外植体的农杆菌遗传转化体系，证明麦草畏(dicamba)可以诱导高粱成熟胚愈伤组织的发生，且有较高的愈伤诱导率。此外，农杆菌介导高粱成熟胚转化时，随着侵染时间的延长，高粱遗传转化率呈先升高后稳定的规律，获得了耐草甘膦转基因高粱新材料。本研究结果为高粱萌动种胚遗传转化体系的建立和遗传改良提供了参考和技术途径。