李慧峰 董庆龙 赵 强 冉 昆

(1山东省果树研究所，山东 泰安 271000；2中国农业科学院果树研究所，辽宁 兴城 125100；3青岛农业大学园艺学院，山东 青岛 266109)

苹果(Malus pumilaMill)是世界上重要的经济果树之一。我国苹果的栽培面积和产量均居世界首位，但环境胁迫因子如病害、干旱、盐碱和极端温度等严重影响苹果的产量和品质，限制了苹果产业的健康可持续发展。APETALA2/ethylene responsive factor(AP2/ERF)转录因子参与调控植物生长发育以及胁迫应答等多个过程，对植物的生长发育和环境适应具有重要作用，因此开展苹果AP2/ERF转录因子研究，可为探索其在逆境调控过程中的生物学功能和利用转基因技术改良及培育苹果新品种奠定理论基础。

AP2/ERF转录因子是植物中研究较为广泛的转录因子家族之一，参与调控植物发育、代谢和响应环境胁迫等多个生物进程[1-4]，其名称源于蛋白上含有60～70个氨基酸组成的AP2/ERF保守结构域。研究表明，AP2 结构域能结合启动子区域的GCC box元件[5]、脱水应答元件(the dehydration responsive element)[6]和/或TTG元件[7]进而调控靶基因的表达。根据氨基酸序列的相似性和AP2/ERF保守结构域的数量，可将AP2/ERF蛋白分为AP2、ERF和RAV 三个亚家族[4，8]。其中，AP2亚家族成员含有2个AP2/ERF保守结构域；RAV亚家族成员含有1个AP2/ERF保守结构域和1个B3 结构域；ERF亚家族成员含有1个AP2/ERF保守结构域，又可根据AP2/ERF保守结构域的第14和第19位氨基酸的不同，进一步细分为ERF和CBF/DREB 两个亚家族[9-10]。多个物种的AP2/ERF转录因子已被分离和鉴定[4，11-12]。研究表明，过表达DREB亚家族成员能够提高转基因株系对多种非生物胁迫的抗性，包括干旱[13-15]、高盐[13，16]、冻害[15]和高温[17]等；过表达ERF亚家族成员不仅能够参与调控防卫基因的表达而提高对多种生物胁迫的抵抗能力[18-21]，而且还能够增强植物对干旱[22-23]、高盐[19]、冻害[24]和渗透胁迫[25]的抗性；AP2亚家族成员在植物生长和发育，包括种子、花器官和果实发育等进程中扮演着重要角色[26-29]；RAV亚家族成员在响应乙烯、油菜素内酯以及生物和非生物胁迫等过程中具有重要作用[30]。

前人关于苹果AP2/ERF转录因子的研究主要集中在果实成熟和软化等方面[31-35]。故本研究在苹果基因组数据库[36]和前人研究结果[37]的基础上，通过序列比对去除GenBank 数据库中已存在的60个苹果AP2/ERF转录因子[32，38]，成功克隆了14个MdAP2/ERF基因，进行进化聚类、亚细胞定位分析，并研究其在苹果不同组织及非生物和生物胁迫下的表达情况，以期为进一步研究苹果AP2/ERF转录因子调控生长发育以及逆境响应等过程奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料及前处理

供试材料为山东省果树生物技术育种重点实验室保存的嘎啦组培苗(Malus domesticacv.Gala)。嘎啦组培苗于继代培养基[MS 培养基+0.2 mg·L-1吲哚乙酸(indoleacetic acid，IAA)+0.8 mg·L-16-苄氨基嘌呤(benzylaminopurine，6-BA)+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂粉)上生长，每隔30 d 继代一次，生长条件为14 h光照/10 h 黑暗，温度24±2℃。选取长势一致(继代20 d 左右)的组培苗，在继代培养基中分别加入150 mmol·L-1NaCl和300 mmol·L-1甘露醇进行处理，以正常继代培养基中生长的组培苗(继代20 d 左右)为对照。

1.2 基因克隆与序列分析

采用改良CTAB 法[39]提取紫弘富士(Malus domesticacv.Zihong Fuji，山东省果树研究所选育品种)叶片RNA，用大连TaKaRa 公司反转录试剂盒PrimeScriptTM1STStrand cDNA Synthesis Kit(Code No.6 110A)合成cDNA。根据已鉴定的MdAP2/ERF基因序列，设计特异性引物(表1)进行PCR 扩增。反应程序:94℃预变性5 min；94℃变性1 min 20 s，56～61℃退火1 min 50 s，72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸10 min。PCR 产物回收后连接到pMD19-T载体上，构建重组质粒，并转化E.coliDH5α 感受态细胞，筛选阳性克隆进行测序。

根据测序获得的cDNA 序列，利用NCBI的BLAST P(https:/ /blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)程序进行同源序列比对；DNAMAN 6.0.3 软件分析基因的ORF和氨基酸序列；MEGA 6.0 软件构建系统进化树。利用NCBI的Conserved Domains(https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)和Pfam 31.0(http:/ /pfam.xfam.org/)程序预测蛋白保守域结构。利用在线软件CELLO v.2.5(http:/ /cello.life.nctu.edu.tw/)、PSORT Prediction(http:/ /psort.hgc.jp/form.html)和SoftBerry ProtComp 9.0 (http:/ /linux1.softberry.com/berry.phtml)进行亚细胞定位预测[40-42]。

1.3 苹果MdAP2/ERF组织表达分析

MdAP2/ERF组织表达数据来自NCBI GEO 数据库，登录号为GSE42873，包含16个不同苹果组织(来自苹果10个不同基因型:M14 叶、M20 花后100 d 果实/采后果实、M49 叶、M67 花、M74 花/花后100 d 果实/采后果实、GD根/茎/幼苗、X4102幼苗、X8877根/茎、X4442×X2596种子和X3069×X922种子，2个重复)的Array，Array 使用探针为苹果基因组V1.0 数据库MDP 识别号。苹果AP2/ERF响应斑点落叶病菌的RNA-seq 数据参考Zhu 等[43]的报道。采用2年生红星离体叶片接种含有斑点落叶病原菌的PDA 培养基，分别侵染0、8、12、18、36、72 h。依据MdAP2/ERF基因的3′-UTR或5′-UTR 设计荧光定量引物(表1)，选取Md18S RNA为内参基因，应用IQ5 PCR 仪(美国Bio-Rad 公司)采用三步法进行荧光定量PCR 分析。所有PCR 反应均设3次重复。PCR 反应体系:SYBR Green Master Ⅰ10 μL，上、下游引物(5 μmol·L-1)各1 μL，模板1 μL，补充去离子水至20 μL。PCR 反应程序:95℃预变性3 min；95℃变性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸15 s，40个循环；最后退火至55℃，每隔7 s上升0.5℃至95℃，共81个循环。采用2-ΔΔCt法进行数据分析[44]。

表1 引物序列及用途Table1 Application and primers of sequences

2 结果与分析

2.1 苹果AP2/ERF基因克隆

测序结果显示，共克隆得到14个AP2/ERF基因。基因命名、开放阅读框、蛋白大小、分子量、等电点、所属类型和GenBank 登录号详见表2。对14个AP2/ERF蛋白氨基酸序列进行同源性比对分析，发现苹果AP2/ERF蛋白均含有AP2 保守结构域(图1)。其中，MdAP2D66-69 含有2个AP2 保守结构域。

表2 苹果AP2/ERF基因信息Table2 The MdAP2/ERF genes in apple

图1 苹果AP2/ERF蛋白的AP2 保守结构域分析Fig.1 Sequence analysis of the AP2 conserved domains in MdAP2/ERFproteins of apple

2.2 苹果AP2/ERF进化分析

通过引入已鉴定的拟南芥AP2/ERF蛋白，利用MEGA 6.0 软件对MdAP2/ERF蛋白进行进化分析，从而确定MdAP2/ERF蛋白的分组[4，8]。由图2可知，AP2/ERF家族分为4个亚家族:DREB、ERF、RAV和AP2。其中，DREB亚家族可进一步分为A-1、A-2、A-3、A-4、A-5和A-6组；ERF亚家族可进一步分为B-1、B-2、B-3、B-4、B-5和B-6组。苹果AP2/ERF蛋白中MdERF12、MdERF37和MdERF20 分别属于DREB亚家族A-2、A-4和A- 6组；MdERF15、MdERF14/21和MdERF9/10/13/30 分别属于ERF亚家族B-3、B-5和B-6组；MdAP2D66/67/68/69属于AP2亚家族。

图2 苹果和拟南芥AP2/ERF蛋白的进化分析和亚家族分类Fig.2 Phylogenetic relationships and subfamily classification of AP2/ERFprotein from apple and Arabidopsis

2.3 苹果AP2/ERF蛋白亚细胞定位预测

通过SoftBerry ProtComp 9.0 软件对MdAP2/ERF蛋白进行亚细胞定位预测。由表3可知，MdERF9-10、MdERF12-15、MdERF20、MdERF30、MdERF37和MdAP2D66-69 定位在细胞核的预测数值均为最高(共10 分:数值越高表示可信度越大)，MdERF21 定位在线粒体的预测数值最高。进一步利用CELLO和PORST 软件进行亚细胞定位预测，预测结果与SoftBerry ProtComp 9.0 分析结果相一致。由此判断，MdERF9- 10、MdERF12-15、MdERF20、MdERF30、MdERF37和MdAP2D66-69 可能位于细胞核，MdERF21 可能位于线粒体。

2.4 苹果AP2/ERF表达分析

利用NCBI 网站的GEO 数据库下载苹果16个不同组织的Array(GSE42873)，检测苹果AP2/ERF基因在不同组织中的表达情况。由图3可知，14个MdAP2/ERF基因在16个不同的被检测组织中均有不同的相对表达水平，其中，MdERF12、MdERF15、MdERF10、MdAP2D67 在根中相对表达水平较高；MdERF12、MdERF21、MdAP2D68 在种子中相对表达水平较高。

进一步检测苹果AP2/ERF基因在斑点落叶病菌侵染下的相对表达水平，发现MdERF20(A6)的转录水平受斑点落叶病菌侵染上调，在侵染72 h 后上调了22.3倍；MdERF12(A2)的转录水平在处理12 h和18 h 后下降，36 h 后上调2.2倍，72 h 后恢复CK水平；MdERF15(B3)的转录水平在处理12 h和18 h 后上调，36 h 后下调到CK的0.6倍，72 h 后恢复CK 水平；MdERF14和MdAP2D66/67/69的转录水平下调，其中在处理72 h 后MdAP2D69的转录水平仅为CK的0.1倍。其他AP2/ERF基因的转录水平无明显变化(图4)。

表3 苹果AP2/ERF亚细胞定位预测Table3 Subcellular localization prediction of MdAP2/ERFproteins

由图5可知，在正常生长条件下，14个苹果AP21ERF基因的相对表达水平无明显变化；在150 mmol·L-1NaCl 处理下，与0 h相比，48 h时MdERF12(A2)、MdERF37 (A4)、MdERF20 (A6)、MdERF15(B3)、MdERF13(B6)、MdERF30(B6)和MDAP2D67相对表达水平升高，其中MdERF37(A4)和MdERF20(A6)的转录水平在处理48 h 后分别上调了25.1倍和50.3倍；而MdERF14(B5)和MdAP2D68 相对表达水平下调，其中MdERF14(B5)的转录水平在处理48 h后仅为0 h的0.14倍(图5-B)。在300 mmol·L-1甘露醇处理下，与对照相比，MdERF37(A4)、MdERF15(B3)、MdERF10(B6)、MdERF30(B6)和MdAP2D66/67/68/69 相对表达水平升高，其中MdAP2D69的相对表达水平最高，在24 h时达到对照的26.3倍；而MdERF14(B5)相对表达水平下调，在处理48 h 后仅为对照的0.08倍(图5-B)。此外，300 mmol·L-1甘露醇处理下，其他MdERF基因的相对表达水平无明显变化(图5-C)。

3 讨论

AP2/ERF转录因子是植物最大的转录因子家族之一。拟南芥基因组中含有147个AP2/ERF蛋白[8]，根据氨基酸序列相似性和保守结构域的数量可分为AP2、ERF(包含ERF和DREB)和RAV 三个亚家族[4，8]。本研究通过引入拟南芥AP2/ERF蛋白，对克隆的14个MdAP2/ERF蛋白进行了亚家族分类，得到3个DREB 成员、7个ERF 成员和4个AP2 成员。进一步研究斑点落叶病菌侵染、NaCl 与甘露醇胁迫下的表达模式，发现DREB亚家族成员MdERF12(A2)对斑点落叶病菌侵染和NaCl 胁迫有响应；MdERF37(A4)对NaCl和甘露醇胁迫有响应；MdERF20(A6)对斑点落叶病菌侵染和NaCl 胁迫有响应。研究表明，DREB 转录因子在应答非生物胁迫过程中具有重要作用[4]。拟南芥A2组成员DREB2A和DREB2B的转录水平受到高盐和干旱诱导，DREB2C、DREB2D和DREB2F转录水平受到高盐诱导[4]，过表达拟南芥和玉米DREB2A能够增强拟南芥和玉米的抗旱能力[17，45]。过表达拟南芥A4组成员HARDY能够增加植株的抗盐和抗旱容忍力[46]。拟南芥A6组RAP2.4转录水平受到盐和干旱诱导，过表达RAP2.4 能够增强植株的抗旱能力[47]。此外，过量表达罂粟(Papaver somniferum)A6组PsAP2 能够增强转基因烟草对病原菌、盐和甘露醇胁迫的抗性[48]。本研究中，MdERF12(A2)、MdERF37(A4)和MdERF20(A6)转录水平受到NaCl 胁迫诱导；MdERF37 转录水平受到甘露醇胁迫诱导，表明DREB 转录因子MdERF12、MdERF37和MdERF20 可能在苹果高盐或渗透胁迫过程中具有重要作用，部分成员MdERF12和MdERF20 在生物胁迫中也可能具有一定作用。

图3 苹果AP2/ERF基因多个组织表达热图Fig.3 Expression profiles of MdAP2/ERF genes in various tissues of apple

图4 苹果AP2/ERF基因在斑点落叶病菌侵染下的表达热图Fig.4 Expression profiles of AP2/ERF genes in response to Alternaria alternata apple pathotype infection

ERF亚家族成员在植物应答生物和非生物胁迫过程中也具有重要作用。拟南芥B3组ERF 成员AtERF1、AtERF2、ERF5 与ERF6 均能够受到渗透胁迫诱导[20]。模拟酸雨胁迫下BrERF2 基因的表达量发生变化，表明其可能参与青花菜抗酸雨胁迫的应答机制[49]。小麦B3组ERF 基因TaPIEP1 受根腐离蠕孢(Bipolaris sorokiniana)诱导，过表达可显著提高小麦植株的抗病性[50]。过量表达B3组ERF 基因NtERF5 与GbERF2的转基因烟草可以明显增强对烟草花叶病毒与褐斑病的抗性[51]。水稻OsERF96 可应答白叶枯病或稻瘟病病原菌的浸染，其启动子是一个对病原菌侵染产生应答的诱导性启动子[52]。过量表达紫花针茅(Stipa purpurea)B3组ERF 成员SpERF1的转基因拟南芥可明显提高对干旱的容忍力[53]。硬质小麦B6组ERF 成员TdSHN1 受盐、干旱、ABA和低温诱导，并且在转基因酵母中过量表达该基因能够增强对盐、渗透和低温的容忍力[54]。本研究中，MdERF12(B3)的转录响应水平斑点落叶病菌侵染和盐胁迫；MdERF10(B6)、MdERF13(B6)和MdERF30(B6)的转录水平响应NaCl 胁迫处理，对甘露醇胁迫处理也有部分应答，表明B3组ERF 成员MdERF12 可能在苹果调控生物胁迫和非生物胁迫过程中起到重要作用；B6组ERF成员MdERF10/13/30 可能在苹果调控非生物胁迫过程中起到重要作用。

此外，AP2亚家族成员不仅在植物生长和发育等进程具有重要作用[26-29]，而且在生物和非生物胁迫中也起关键作用[55-56]。过量表达烟草Tsi1 不仅能够增强植株的抵抗病原菌的能力，还能够增强植株的渗透胁迫能力[55]。胡椒(Capsicum annuumcv.Bukang)CaPF1 受乙烯(ethylene，ET)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)和冷胁迫诱导表达，过表达该基因不仅可以提高拟南芥对低温的抗性，而且可以提高对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000)的抗性[56]。本研究中，苹果AP2 成员MdAP2D66/67/69的转录水平受到斑点落叶病菌侵染下调，多数成员的转录水平在NaCl 胁迫处理下无明显变化，但全部成员MdAP2D66/67/68/69的转录水平均受甘露醇胁迫处理诱导，表明MdAP2D66/67/68/69 可能在病原菌应答过程和渗透胁迫中具有重要作用。

4 结论

本研究克隆了14个MdAP2/ERF基因，其中，MdERF12、MdERF37和MdERF20 分别属于DREB亚家族A-2、A-4和A-6组；MdERF30、MdERF15、MdERF14/MdERF21和MdERF9/MdERF10/MdERF13分别属于ERF亚家族B-1、B-3、B-5和B-6组；MdAP2D66-69属于AP2亚家族。亚细胞定位预测表明，除MdERF21 定位于线粒体外，其他成员均定位于细胞核。Array和RT-qPCR 分析表明，MdAP2/ERF基因在斑点落叶病菌、NaCl和甘露醇胁迫下表达水平被诱导上调或下调，推测其可能参与调控苹果生物胁迫和非生物胁迫应答的过程，为进一步揭示苹果AP2/ERF转录因子调控生长发育以及逆境响应等机理奠定了基础。