朱健伟，李玉娟

（乐山市中医医院 1.肺病科，2.肾病科，四川 乐山 614000）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）属于一类进行性系统性自身免疫疾病，发病机制复杂，多累及肺脏[1]。有研究显示，类风湿关节炎相关间质性肺疾病（rheumatoid arthritis related interstitial lung disease, RA-ILD）是导致RA患者死亡的主要原因之一[2]。因此，加强RA-ILD的早期筛查，及时给予防治措施，是改善患者预后的关键。但由于RA-ILD起病隐匿，发病早期缺乏典型的临床指征，诊断困难[3]。肺活检创伤性较大，取材受限；肺部高分辨CT（high resolution computer tomography, HRCT）不仅检查成本高，而且RA-ILD患者发病早期的影像学特征不典型，易发生误诊[4]。MicroRNAs（miRNAs）属于一类小的非编码RNA，可参与多种疾病的生理过程[5]。而且循环miRNAs具有高度的稳定性和特异性，分离和检测操作简单易行，对疾病的诊断具有其独特的临床优势。既往已有动物[6]和细胞实验[7]证实，miR-200c在肺纤维化过程中发挥着关键作用。本项研究旨在探讨RAILD患者血清miR-200c表达水平与肺间质纤维化评分的相关性，探讨两者对RA-ILD患者的早期诊断价值，以及与间质病变程度的相关性，从而为临床早期诊断和治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月—2018年8月在乐山市中医医院肺病科就诊的RA患者87例作为研究对象（RA组）。其中，男性26例，女性61例；年龄21～78岁，平均（58.65±10.44）岁。纳入标准：①所有RA患者符合2010年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟制定的类风湿关节炎诊断标准[8]；②年龄≥18岁，男女不限；③临床资料及治疗过程完整。排除标准：①由环境、物理因素、药物因素、吸烟、尘肺及吸入有机药物等因素引起的间质性肺疾病（interstitial lung disease, ILD）以及特发性ILD；②伴有明确诊断的其他自身免疫性疾病；③有恶性肿瘤、肺结核、慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张及肺部急慢性感染等呼吸系统疾病史。根据临床症状、胸部HRCT及X射线检查评估结果，将RA组分为RA-ILD组34例及非ILD组53例。RA-ILD组符合2002年美国胸科协会和欧洲呼吸学会达成共识的相应的RA-ILD分类诊断标准[9]，并且为ILD初诊患者。其中，男性14例，女性20例；年龄41～78岁，平均（61.36±7.82）岁。非ILD组男性12例，女性41例；年龄21～77岁，平（56.81±10.70）岁。另选取同期30例健康志愿者作为对照组。其中，男性9例，女性21例；年龄33～75岁，平均（59.12±11.34）岁。所有实验过程均遵从赫尔辛基宣言原则，并通过医院伦理委员会批准，患者及其家属知情同意。

1.2 方法

1.2.1 一般资料收集分析患者的年龄、性别、体重指数（BMI）、病程、吸烟史、临床症状和体征等。

1.2.2 生物化学指标检测白细胞（WBC）、血小板（PLT）、红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate, ESR）、免疫球蛋白及类风湿因子（rheumatoid factor, RF）等生物化学指标。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）采用Trizol法提取血液总RNA；进一步采用mirPremier® microRNA Isolation Kit（美国Sigma公司） 试剂盒分离miRNAs，根据SuperScript RT Kit（日本TaKaRa公司）说明书合成cDNA。以细胞或组织cDNA为模板，以小分子U6作为内参。按照SYBR Green PCR Master Mix（美国Thermo-Fisher公司）说明书进行qRT-PCR。PCR反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共计40次循环，60℃继续延伸5 min。根据NCBI数据库获得的资料设计引物，由武汉金凯瑞生物工程有限公司合成。根据使用说明调整基线，将阈值设定在荧光值对数图的线性部分，从软件中读取Ct值。ΔCt=样品Ct均值-内参Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-（随机阴性对照样品Ct均值-内参Ct均值），以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相对表达量。

1.2.4 肺功能检查采用FGC-A+型全自动肺功能测试仪（苏州同科科教设备有限公司）测试患者的肺部功能，包括通气功能和一氧化氮弥散功能（diffusion rate for carbon monoxide, DLCO）。肺通气功能损害程度分级为①轻度：1秒用力呼气容积（forced expiratory volume in one second, FEV1）≥80%；②中度：FEV1 50%～＜80%；③重度：FEV1＜50%。DLCO损害程度分级为①轻度：DLCO 60%～＜80%；②中度：DLCO 40%～＜60%；③重度：DLCO＜40%。

1.2.5 HRCT采用Asteion 4层螺旋CT（日本东芝公司）进行HRCT扫描，HRCT扫描参数为135 kV，200 mA，轴距扫描，层厚1 mm，层距5 mm，骨窗计算方法，于主动脉弓、隆突、和膈肌上方1 cm 3个基准水平各做1×4层扫描。分别计算3个层面纤维化占相应肺野面积的百分比。根据毛玻璃影、小叶间隔增厚、蜂窝影的累及范围进行评分，①0分：无异常；②1分：累及范围1%～25%；③2分：累及范围＞25%～50%；④3分：累计范围＞50%～75%；⑤4分：累及范围＞75%。将评分相加即为间质性肺病评分。所有HRCT均由2位副主任医师以上职称放射科医师共同评分，取平均值。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）或中位数和四分位数间距[M（P25，P75）]表示，比较用t检验或方差分析或秩和检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ2检验；相关分析用Spearman法，绘制ROC曲线，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RA组与对照组血清miR-200c水平比较

RA组与对照组血清miR-200c水平分别为（1.35±0.47）和（1.07±0.38），经独立样本t检验，差异有统计学意义（t=2.945，P=0.004），RA组高于对照组。RA-ILD组与非ILD组血清miR-200c水平分别为（1.48±0.32）和（1.24±0.30），经独立样本t检验，差异有统计学意义（t=3.547，P=0.001），RAILD组高于非ILD组。

2.2 RA-ILD组与非ILD组一般资料比较

RA-ILD组与非ILD组年龄、BMI、吸烟史及ILD评分比较，经独立样本t检验或χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05），RA-ILD组高于非ILD组。RA-ILD组与非ILD组病程、肿胀关节数及压痛关节数比较，经秩和检验，差异有统计学意义（P＜0.05），RA-ILD组多于非ILD组。RA-ILD组与非ILD组性别、WBC、PLT、ESR、RF、免疫球蛋白G（Immunoglobulin G,IgG）、免疫球蛋白A（Immunoglobulin A, IgA）及免疫球蛋白M（Immunoglobulin M, IgM）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 RA-ILD组与非ILD组一般资料比较

续表1

2.3 不同肺功能RA-ILD患者血清miR-200c水平比较

检查肺功能中的通气功能，34例RA-ILD组患者中，13例为轻度肺通气功能障碍，12例为中度肺通气功能障碍，9例为重度肺通气功能障碍，不同通气功能患者血清miR-200c水平比较，经方差分析，差异统计学意义（P＜0.05）；且两两比较均差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

检查肺功能中的弥散功能，34例RA-ILD组患者中，15例为轻度肺弥散功能障碍，11例为中度肺弥散功能障碍，8例为重度肺弥散功能障碍，不同弥散功能患者血清miR-200c水平比较，经方差分析，差异统计学意义（P＜0.05）；且两两比较均差异有统计学意义（P＜0.05）。随着肺通气功能障碍和肺弥散功能障碍程度的加重，患者血清miR-200c水平逐渐升高。见表2。

表2 不同肺功能RA-ILD患者血清miR-200c水平比较 （n =34，±s）

表2 不同肺功能RA-ILD患者血清miR-200c水平比较 （n =34，±s）

注：①与轻度者比较，P ＜0.05；②与中度者比较，P ＜0.05。

肺功能 n miR-200c F值 P值通气功能 轻度 13 1.22±0.27 11.638 0.000 中度 12 1.54±0.26① 重度 9 1.79±0.25①②弥散功能 轻度 15 1.22±0.25 9.971 0.001 中度 11 1.61±0.39① 重度 8 1.78±0.29①②

2.4 RA-ILD患者血清miR-200c水平与ILD评分的相关性分析

经Spearman相关性分析，RA-ILD患者血清miR-200c水平与HRCT检查的ILD评分呈正相关（rs=0.889，P=0.000）。见图1。

图1 RA-ILD组患者血清miR-200c水平与ILD评分的相关性分析

2.5 血清miR-200c诊断RA-ILD的效能分析

绘制ROC曲线分析，血清miR-200c诊断RAILD的AUC为0.787（95% CI：0.687，0.887），敏感性为78.79%（95% CI：0.734，0.792），特异性为62.96%（95% CI：0.601，0.684），约登指数为0.420，截断值为1.195。见图2。

图2 血清miR-200c诊断RA-ILD的ROC曲线

3 讨论

RA发病原因复杂，是由多种细胞因子、趋化因子和黏附因子等共同参与的免疫过程，易侵犯全身血管和结缔组织，尤其以肺脏为主要受累对象，发病率高达20%以上，可能与肺脏具有丰富的血管和结缔组织有关[10]。但是因肺部受累临床表现及影像学特征并不典型，易与常见的原发性肺部疾病混淆，所以在临床诊疗中漏诊和误诊率较高。本研究共纳入87例RA患者，经胸部HRCT和X射线检查评估，34例患者发生ILD，但并非所有RA-ILD患者都表现出典型的临床症状。目前胸部HRCT和X射线检查是我国临床最常使用诊断ILD的金标准。但是多年来的临床经验证实，X射线检查不仅具有辐射性，而且敏感性相对也较低[11]；HRCT虽然敏感性及特异性均高于X射线，但是检查费用较贵，在县级以下的医疗机构中无法实现大规模推广。因此，从我国现实国情和医疗水平出发，寻找高危患者并进行针对性的监测是最切实可行的方案之一。

本研究中的RA患者以女性为主，且年龄越高，发生ILD的风险越大。有研究证实，＞65岁结缔组织疾病患者发生ILD风险较≤65岁患者增加4倍以上。其原因可能是随着年龄增长，机体免疫功能下降[12]。另外，BMI、病程、吸烟史及受累关节数量等也是影响RA患者发生ILD的危险因素。BMI越高，身体对关节尤其是膝关节和踝关节的压力越大；而受累关节越多，关节破坏程度越严重，则机体内炎症因子、趋化因子及免疫因子等水平越高，更易造成肺损伤[13]。本研究还发现，RA-ILD组血清miR-200c水平高于非ILD组，并且随着病情加重，miR-200c表达水平逐渐升高。

有动物研究显示，肺纤维化模型小鼠的肺泡上皮细胞中miR-200c表达上调，可能与肺纤维化过程中上皮细胞间质化转化有关[14]。LIU等[15]也进一步证实，miR-200c主要表达于肺泡上皮细胞，是参与肺上皮细胞间质化转化的关键基因，通过调控下游靶基因ZEB1的转录和翻译，促使肺组织发生纤维化。但是目前临床研究较少探讨miR-200c与ILD的关系。本研究发现，RA组血清miR-200c高于对照组，说明miR-200c可能也是参与炎症反应或免疫反应的关键分子。RA-ILD组血清miR-200c水平高于非ILD组，而且与肺通气功能障碍和弥散功能障碍严重程度关系密切。进一步通过ROC曲线分析miR-200c的诊断效能，发现血清miR-200c诊断RA-ILD的效能较高。

综上所述，高龄、超重、RA病史长、吸烟及受累关节数量多均为RA-ILD发生的危险因素。对有高危因素的RA患者，应密切监测，并建议定期行HRCT或X射线检查复查，早诊断、早干预以改善预后；另外，血清miR-200c水平有望成为RA-ILD患者的有效诊断指标，且与患者ILD的严重程度有关。