程义成 孔祥伟 吴江 尹伟 沈彬 刘向辉

种植体周围感染是引起种植体失败的最重要原因之一[1]。牙科种植体是一个穿龈结构，其上部结构暴露在口腔这个复杂的微生态系统中[2]，口内的细菌极易黏附于穿龈的基台表面，并穿过种植体基台-软组织的结合界面进入深层引发炎症甚至破坏骨结合[3]。良好的种植体基台部软组织生物学封闭对于种植体成功率和使用寿命至关重要。然而临床常用的光滑基台难以形成并维持生物学封闭[4]。针对以上情况，本研究选择具有明确促进软组织细胞生长的结缔组织生长因子，制作缓释纳米微球，并通过渗涂交联法在纯钛微弧氧化涂层表面构建复合涂层，为下一步应用于种植体基台表面奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

材料：结缔组织生长因子(CTGF)、聚L-乳酸(PLLA，Mw：152 000)、聚乙烯醇(PVA)及明胶(Sigma-Aldrich、美国)；CTGF ELISA试剂盒(Ray Biotech，美国)；β-甘油磷酸二钠盐五水(β-GP，国药集团)；乙酸钙(CA，天津协和)；纯钛板(TA2，宝钛集团)。

仪器：超声波细胞粉碎仪(JY92-IIN型，宁波新芝)；扫描电子显微镜(S-4800型，日立，日本)；激光粒径分析仪(Mastersizer 2000型，Malvem Instruments，英国)；微弧氧化相关设备(西安理工大学自制)等。

1.2 方法

1.2.1 CTGF/PLLA纳米微球的制备 采用复乳法制备CTGF/PLLA纳米微球。将5 mg CTGF溶于0.2 ml去离子水中作为内水相；100 mg PLLA溶于2 ml二氯甲烷中作为油相。将内水相逐滴加入油相中，在冰水浴中超声波细胞粉碎仪超声乳化(功率80 W)1 min形成初乳。再加入10 ml 1%的PVA水溶液，继续超声乳化1 min形成复乳。以500 r/min转速磁力搅拌12 h后在15 000 r/min转速下离心20 min，分离收集微球，并用蒸馏水洗涤3次，经冷冻干燥后得到微球粉末。扫描电镜观察微球表面形貌，并应用激光粒度分布测试仪测定其粒径，重复测定6 次。

1.2.2 微弧氧化涂层(内涂层)制备 将纯钛板线切割成方片状(10 mm×10 mm×2 mm)试样，耐水砂纸逐级打磨至1200#后抛光。以纯钛片为阳极，不锈钢锅为阴极，在含有0.04 mol/L β-GP和0.2 mol/L CA的水溶液中采用脉冲直流电进行微弧氧化处理(电压300 V，频率600 Hz，占空比8.0%，处理时间5 min)。抛光纯钛及纯钛微弧氧化涂层试样均应用扫描电镜观察表面形貌。

1.2.3 纯钛表面复合纳米微球涂层的构建 20 mg CTGF/PLLA纳米微球超声分散于5 ml的0.2%的明胶溶液中。取400 μl 纳米微球悬液滴至纯钛微弧氧化涂层试样表面，在漩涡振荡器上振荡1 h后在4 ℃干燥，再将其浸泡于2.5%的戊二醛溶液中30 min，使明胶发生交联反应，最后用无水乙醇清洗试样3 次以除去残留戊二醛。扫描电镜观察涂层表面形貌。

1.2.4 复合纳米微球涂层释药特性研究 将制备出来的一片涂层试样浸入5 ml磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.4)缓冲液中，再转移至透析袋内放入盛有20 ml PBS缓冲液的三角烧瓶内，密封后置于振荡培养箱中恒速振荡(37 ℃，100 r/min)。在预定的时间点从袋外缓冲液中取样1 ml，并立即补加等量同质同温PBS。利用ELISA法测定取样中CTGF含量，从而计算其释放浓度和累计释放百分率，重复该研究6 次，并绘制释药曲线。

1.2.5 复合纳米微球涂层降解形貌观察 按照1.2.4方法将试样放置于PBS中，分别在1、10、20和30 d时从透析袋里取出试样，干燥喷金后扫描电镜观察涂层降解形貌。

2 结 果

2.1 CTGF/PLLA纳米微球制备

CTGF/PLLA纳米微球平均粒径为(376.5±18.2) nm。扫描电镜下可见微球呈现良好的球面形态，表面无明显粘连和聚合，粒径分布比较均匀(图1)。

图1 纳米微球扫描电镜图

2.2 微弧氧化涂层

扫描电镜下观察可见抛光纯钛试样表面光滑，微弧氧化处理后在纯钛表面形成了多孔状涂层，微孔大小不均，其孔径在1～3 μm之间(图2)。

图2 抛光纯钛及微弧氧化涂层扫描电镜图

2.3 纯钛表面复合纳米微球涂层

图3为扫描电镜下观察到的纯钛表面复合纳米微球涂层形貌，可见微球主要黏附在微弧氧化涂层的微孔中，通过明胶彼此交联并交联至微孔壁。

图3 纯钛表面复合纳米微球涂层扫描电镜图

2.4 纯钛表面复合纳米微球涂层释药曲线

图4为复合纳米微球涂层释药曲线，可见涂层的释药特征表现为少量的初期突释以及随后的药物缓慢释放的两相曲线。突释阶段可见14.6%的CTGF在前8 h内从该涂层中释放；而在随后的30 d里，有71.8%的CTGF从涂层中缓慢释放。

图4 纯钛表面复合纳米微球涂层释药曲线

2.5 纯钛表面复合纳米微球涂层降解形貌

扫描电镜下观察到的涂层降解形貌见图5。1 d后涂层中微球的变化并不显著，10 d后可见涂层中的微球出现了少量变形，涂层中微球数量也少量减少；降解20 d后涂层中微球出现了明显变形，涂层中微球的数量明显减少了；随着时间的推移，涂层中的微球的形态变化和数量减少都更加明显，在降解30 d后大部分微球已经从涂层的微孔中脱落，微弧氧化涂层的微孔中只剩下少量变形了的微球。

图5 纯钛表面复合纳米微球涂层降解扫描电镜图

3 讨 论

钛是目前应用最为广泛的种植体材料，在生理条件下钛表面会形成一层蛋白层，该蛋白层既利于细胞的黏附，同时也非常适合细菌的黏附[5]。牙科种植体是一个穿龈的结构，口内的细菌会通过种植体基台与软组织结合的部位侵入引发感染甚至破坏下方的骨结合[6]。因此，在种植体基台部尽快形成一个稳定、有效的软组织生物学封闭是提高种植体成功率和使用寿命的关键问题之一。然而目前临床常用的光滑基台难以形成并维持生物学封闭[7]。近年来种植体基台表面加载生物活性因子的涂层逐渐成为了研究的热点[8]。本研究选择了CTGF来制备涂层，CTGF具有显著促进成纤维细胞黏附和增殖作用[9]，并且CTGF在低浓度时仍能发挥生物学功能。

微弧氧化是一种常用的金属表面改性技术，可以在钛表面形成多孔状涂层[10]。在含有钙和磷的电解液中处理，还能将钙和磷元素引入到涂层中从而增加其生物活性[11]。同时，微弧氧化涂层多孔状的结构也给载药微球的黏附提供了空间[12]。在本研究中，纯钛在微弧氧化后形成了孔径1～3 μm的多孔状涂层，而制备出来的CTGF/PLLA纳米微球平均粒径为376.5 nm，远小于微孔孔径，给复合纳米微球涂层的构建提供了可能。构建出来的涂层经扫描电镜观察微球主要集中在微弧氧化的微孔中，通过明胶彼此交联至微孔壁。通过物理嵌合和化学交联2 种方式有效防止载药微球从纯钛表面脱落。

将CTGF制备成载药微球并交联至微弧氧化纯钛表面构建复合涂层，不仅可以实现药物的缓慢和局部释放，还可以提高其生物利用度。体外释药研究表明该复合纳米涂层的释药特征表现为少量的初期突释以及随后30 d的药物缓慢释放。研究表明吸附在微球表面或接近表面的药物迅速溶解至释放介质中是造成药物突释的主要原因[13]。随着PLLA的不断降解，微球中包裹着的CTGF也随之释放从而形成了药物的缓慢释放。从复合纳米微球涂层的降解电镜照片可见，涂层的降解表现为两方面：随着时间的推移微球自身的变形降解以及微球表层降解后逐步从微孔中脱落，降解30 d后微孔中只剩下少量变形了的微球。

综上所述，本研究在纯钛表面构建出了具有缓慢释放CTGF的复合纳米微球涂层，载药微球良好分布并固定在微弧氧化涂层的微孔中，该涂层是一种潜在的应用于牙科种植体基台表面的促进软组织封闭的涂层，具有良好的应用前景。