徐海明，郝艳星，陈娅楠，杨惠芳，李江平，朱玲勤，任彬彬，德小明

(宁夏医科大学公共卫生与管理学院职业卫生与环境卫生学系，宁夏 银川 750004)

人体内的胆碱酯酶(cholinesterase，ChEs)按照水解底物的差异可分为乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)和丁酰胆碱酯酶(butyrocholinesterase，BChE)。50 年代初期，AChE 就用来评价有机磷农药、氨基甲酸酯类农药中毒情况。有越来越多的证据表明，人体内的ChEs 发挥着越来越多的生理学功能[1-2]。具体来说，AChE 与细胞黏附、增殖、凋亡等生理活动密切相关[3-4]；BChE 既与解毒存在密切关联，同时被应用到恶性肿瘤预后分析及临床疾病诊断等领域[5-8]。

定量检测ChEs 的方法有很多，主要包括改良Ellman法、丁酰硫代胆碱/六氰高铁酸钾(Ш)法(由德国临床化学协会推荐，简称DGK 法)、P-羟基苯甲酰胆碱偶联对羟基苯甲酸-3-单加氧酶法(日本临床化学协会推荐，简称JSCC 法)、羟胺三氯化铁法(标准号为WS/T66-1996)。

羟胺三氯化铁法测定ChEs得到了广泛应用，但呈现出一定的应用局限性，比如不适合通量测定，需在较短时间内完成比色测定，容易产生沉淀等。本研究旨在对羟胺三氯化铁法进行条件优化，以改进上述不足，达到微孔板测定的目的。

1 材料与方法

1.1 血清标本及试剂

本研究中所用到的人体血清标本来自宁夏某职业病防治医院在岗期间进行职业健康体检的长期吸入游离二氧化硅的作业人员。本研究得到了宁夏医科大学医学伦理委员会批准并获得所有研究对象的知情同意。本研究中用到的主要试剂如表1所示。

表1 胆碱酯酶测定试剂

1.2 方法

1.2.1 羟胺三氯化铁法测定人血清标本中AChE酶活性在参照测定全血胆碱酯酶活性的分光光度法(羟胺三氯化铁法WS/T66-1996)的基础上，对部分实验细节进行调整：将冻存于-80 ℃人体血清放置于-4 ℃缓慢融化。对照管和样品管各加20 μL 人体血清，10 μL iso-OMPA 抑制剂，用PBS 溶液补足至1 mL。使用可见分光光度计(VIS-7220N，北京北分瑞利)测定AChE的吸光度时，用蒸馏水调零，其余步骤、条件及酶活性计算方法参照羟胺三氯化铁法(WS/T66-1996)。

1.2.2 羟胺三氯化铁法测定人血清标本中BChE酶活性参照本实验优化的羟胺三氯化铁法测定AChE 酶活性实验方案与预实验结果，对部分实验细节微调：加入血清5 μL，反应底物为6.99 μmol/L BTCh 应用液，抑制剂为10 μL BW284C51，其余步骤、条件及计算与本研究优化的羟胺三氯化铁法测定AChE 酶活性实验方案一致。

1.2.3 微孔板羟胺三氯化铁法测定人血清标本中BChE 酶活性做预实验以确定最佳稀释倍数。稀释倍数分别设为0.2、1.67、5、16.7、50。分别取5 μL不同稀释倍数的人血清到微孔板。实验结果中，稀释倍数为0.2、1.67、5 的血清会产生肉眼可见的沉淀，稀释倍数为50 倍的血清无法测出BChE 值。故本实验取用稀释16.7倍的血清。所用反应底物为6.99 μmol/L BTCh应用液。

设立标准孔、对照孔、样品孔。对照孔和样品孔分别加入5 μL稀释后血清(稀释16.7倍)，2 μL抑制剂BW284C51，PBS 溶液补足到20 μL。37 ℃预热10 min。对照孔加入80 μL 碱性羟胺溶液和30 μL 应用液，样品孔只加30 μL 应用液，37 ℃保温箱孵育30 min。标准孔中分别加入0、4、8、12、16、20 μL 应用液，PBS溶液补足至40 μL(标准孔无需加热)。样品孔和标准孔加80 μL 碱性羟胺溶液振荡3 min。所有孔中加40 μL 的1+2 HCl 溶液振荡2 min，之后加入40 μL FeCl3溶液，使用全波长酶标仪(Thermo Multiskan GO，Thermo Scientific)测定吸光度值，测定波长为520 nm。利用标准曲线计算样品的BChE 酶活性。

1.2.4 改良Ellman 法测定人血清标本中BChE 酶活性取5 μL 稀释后的血清(稀释倍数为300 倍)，80 μL Na2HPO4，10 μL DTNB，2 μL BW284C51，蒸馏水补足至150 μL，室温避光放置30 min，加10 μL浓度为12.5 mmol/L BTCh，40 μL双蒸水，412 nm酶标仪测定吸光度值，吸光度测定间隔2 min，时长10 min，ΔA/min与BChE成正比。

1.2.5 优化后方法的准确性及可靠性验证为了验证优化后测定方法的准确性和可靠性，参照羟胺三氯化铁法(WS/T66-1996)的规范要求，依次对优化后测定方法的最低检测浓度(检测限)、线性范围及变异系数进行了测定。

1.3 统计学方法

使用SPSS 22 进行数据统计分析，计量资料采用平均数±标准差(xˉ±s)或中位数±四分位间距(M±Q)进行描述。对于符合双变量正态分布的数据，用Pearson积差相关系数r 表示相关性检验结果。对于不符合双变量正态分布的数据，采用Spearman 等级相关系数rs表示。使用R语言作图。双侧检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 羟胺三氯化铁法测定人血清中AChE酶活性的灵敏度

羟胺三氯化铁法测定人血清标本中AChE 酶活性的实验结果如图1 所示。结果表明，在羟胺三氯化铁法体系中，加入一定剂量的iso-OMPA 后，血清体积与AChE 含量测定值之间并没有表现出正相关关系。同样，在微孔板体系中，加入一定剂量的iso-OMPA后，血清体积与AChE 含量测定值之间也没有表现出正相关关系。这一结果给人造成的一种假象是血清体积越大，酶的活性越低。根据笔者理解，这一结果或与血清体系中AChE 酶活性含量过低以及体系中其他干扰因素影响测定有关。这一结果提示我们，羟胺三氯化铁法或不适用于人血清AChE酶活性的测定。

2.2 不同方法测定人血清标本中BChE酶活性

表2 所示为基于改良Ellman 法进行人血清BCHE酶活性测定时最佳稀释倍数的确定。判定稀释倍数是否理想的依据是横向比较同一稀释倍数时总ChEs酶活性(测定体系中不加BW284C51)和BChE酶活性(测定体系中加BW284C51)，如果两者结果之间具有显著性差异，视为结果理想。结果表明，当血清稀释100 倍且测定体系中加入2 μL BW284C51时，BChE 酶活性的测定结果最为理想(表2)。

图1 羟胺三氯化铁法测定人血清标本中AChE酶活性时血清体积与测定结果的关系

表2 人血清BChE酶活性测定最佳稀释倍数的确定(改良Ellman法)

表3 所示为使用羟胺三氯化铁法和微孔板羟胺三氯化铁法测定同一批人血清标本中BChE 酶活性的结果比较。结果表明，两种方法均可有效测定血清标本中BChE 酶活性，测定结果之间存在正相关关系(rs=0.653，P＜0.01)。

表3 使用不同方法测定同一批人血清标本中BChE酶活性的结果比较

2.3 不同方法测定人血清标本中BChE酶活性的相关性分析

表4所示为不同方法测定人血清标本中BChE的相关性分析。结果表明，羟胺三氯化铁法、微孔板羟胺三氯化铁法与改良Ellman法测定结果之间均存在正相关关系(P＜0.01)；微孔板羟胺三氯化铁法与羟胺三氯化铁法测定结果之间也存在正相关关系(P＜0.01)。以上结果提示，羟胺三氯化铁法与微孔板羟胺三氯化铁法测定结果均具有较高的可靠性。

2.4 优化后方法的准确性及可靠性

表5 所示为优化前后方法的准确性及可靠性分析。结果表明，与羟胺三氯化铁法(WS/T66-1996)方法相比，微孔板羟胺三氯化铁法的准确性及可靠性略佳，主要体现在最低检测浓度及变异系数上。

表4 不同方法测定人血清标本中BChE的相关性分析

表5 优化前后方法的准确性及可靠性相关数据

3 讨 论

目前的研究中，文献报道的全血胆碱酯酶活性的分光光度测定方法往往不区分是何种胆碱酯酶，也没有加抑制剂的概念[9]。一些研究虽加入抑制剂，却是用一种抑制剂同时测定AChE与BChE。因两种胆碱酯酶的生理活性不同，BChE与AChE的反应底物结合能力，BChE 水解BTCh 的速度大于ATCh。所以笔者认为，从定量测定AChE与BChE酶活性的角度考虑，应该加入相应的抑制剂，对酶活性分别检测。具体地说， 测定BChE 加入AChE 的特异性抑制剂BW284C51，测定AChE 加入BChE 的特异性抑制剂iso-OMPA[10-11]。

在本研究中，加入iso-OMPA 的羟胺三氯化铁法不适宜测定AChE，可能原因是人体血清中AChE 较BChE 含量甚微，后者大约是前者的10 倍，而该法灵敏度较低。另外加入iso-OMPA 后，底物抑制现象明显[12]，据此推测加入iso-OMPA的羟胺三氯化铁法测定人体血清AChE 效果差。用羟胺三氯化铁法测定BChE，因人体血清BChE 含量丰富，且底物浓度增加时，BCHE 酶活性变化不明显。所以用优化的羟胺三氯化铁法测BChE较理想。

如前所述，优化的羟胺三氯化铁法的局限性主要包括不适合通量测定，需在20 min内完成比色，容易产生沉淀。优化后的微孔板羟胺三氯化铁法可以有效解决上述问题，表现出一定的方法学优势(表6)。

表6 不同方法测定人血清中BChE酶活性结果比较

总之，微孔板羟胺三氯化铁法是一种通量较高、经济性较好的测定人血清标本中BChE 酶活性的方法，有一定的应用前景。