阮美丹，曾祥法，韩林涛，李晶晶

(湖北中医药大学基础医学院，武汉 430065)

栝楼-薤白是中医治疗胸痹的经典药对，栝楼、薤白二者为伍涤上焦之痰浊，散阴寒之凝滞，宽胸中之闭塞，使固寒痰滞得解，胸阳得振而平，为治疗胸阳不振、寒痰湿浊凝滞于胸中之胸痹心痛的最佳组合[1]。现代药理研究表明，栝楼能扩张冠状动脉，增加血流量，提高耐缺氧能力[2]，保护缺血心肌；薤白具有调血脂、抗动脉粥样硬化[3]、抑制血小板聚集、抗氧化[4]、保护心肌缺氧缺血及缺血再灌注心肌损伤等作用[5]。由于中药成分复杂，栝楼-薤白药对在治疗慢性心肌缺血产生的整体药效及其作用机理一直是现代研究的难点。代谢组学(Metabonomics)是通过对生物系统因病理生理或基因改变等刺激所致动态多参数代谢应答的定量测定，了解生物体内源性代谢物质的整体及其变化规律的科学[6-7]。本实验运用核磁共振技术和代谢组学方法，对慢性心肌缺血大鼠血清代谢物进行分析，寻找慢性心肌缺血的生物标志物，研究其对应的代谢通路来阐明栝楼-薤白药对治疗慢性心肌缺血大鼠的作用机理。

1 材料

1.1 仪器

600 MHz带超低温探头的核磁质谱仪Bruker Avance III 600 MHz NMR sepctrometer equipped with inverse detedtion cryoprobe(Bruker BiospinRheinstetten,Germany)；涡旋仪，低温真空离心机(SC110 A，Thermo，Germany);Synergy Ultrapure Water System From Millipore(Billerica，MA);光学显微镜(奥林巴斯BX53型生物显微镜)。

1.2 药品和试剂

栝楼(购于湖北强康中药饮片有限公司，批号161101)、薤白(购于湖北强康中药饮片有限公司，批号161001)，分别经湖北中医药大学中药教研室杨红兵鉴定为葫芦科植物栝楼(Trichosanthes kirilowi)的干燥药材和百合科植物薤白(Allii macrostemi bulbus)的干燥药材。甲醇、磷酸钠(TSP)购于Sigma-Aldrich(St.louis，MO，USA)、低浓度米酿酒、石蜡(国药集团，货号69019361)、二甲苯(国药集团，货号10023418)、苏木素、伊红Y(水溶性)，乙醇(国药集团，货号10009218)、多聚甲醛、盐酸异丙肾上腺素(ISO)。

2 方法

2.1 分组造模

表1显示， 将18只SD雄性大鼠按随机数字表法分为栝楼-薤白组、模型组、正常组3组各6只。模型的建立参照文献[8-9]，采用小剂量长时间给予大鼠盐酸异丙肾上腺素造成慢性心肌缺血模型，栝楼-薤白组和模型组分别连续腹腔注射6 d ISO 0.04 mg/kg制造慢性心肌缺血模型，正常组腹腔注射生理盐水0.04 mg/kg。按慢性心肌缺血阳性判断标准：以ST 段水平向下或向上偏移≥0.11 mv；T波高耸；超过同导联R波的1/2；T波高耸伴ST 段移位；符合其中之一者即可。造模后，各组ST段电压会有所抬高，提示造模成功。给药后，栝楼-薤白组ST段电压下降，说明栝楼-薤白药对对慢性心肌缺血大鼠有治疗作用。

表1 栝楼-薤白对慢性心肌缺血大鼠ST段影响比较

注：与正常组比较：P*<0.05，P**<0.01；与模型组比较：△P<0.05，△△P<0.01

2.2 给药取材

取栝楼实25 g(栝楼子12.5 g、栝楼皮12.5 g)，薤白12.5 g，白酒7 L(低浓度米酿酒，1400 mL)共煎，浓缩至2 L(400 mL)，栝楼-薤白含生药量为1.875 g/ml，按比例制备足够数量，保存在-80 ℃低温冰箱中，临用时取出。栝楼-薤白组大鼠灌服栝楼-薤白煎液，模型组、正常组灌服生理盐水。各组每日灌胃1次，灌胃容量20 mL/kg。大鼠放置在SPF级室内饲养，晚上定时投放食料，自由饮水，连续给药14 d。末次给药后禁食12 h，第2天上午进行取材。

2.3 样本制备及前处理 连续给药14 d后，所有大鼠用10%的水合氯醛(4 mL/kg)进行麻醉，然后断头取血，用加EDTA-K2抗凝剂采血管收集血液，血液于3000 rpm离心10 min，取血清放到-20 ℃低温保存以备用。另外采用全自动生化分析仪检测血清中的中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平。分别取动物心脏，用生理盐水洗净，固定于4%多聚甲醛中，石蜡包埋、切片，二甲苯脱蜡，HE染色，梯度乙醇脱水、封片以备用。

取出冰冻血清样本，4 ℃解冻操作，涡旋30 s，取300 μL血样加入-20 ℃预冷的甲醇涡旋10 s，放置-20 ℃环境20 min冰冻处理。然后进行离心处理：4 ℃ 12000 r/min，10 min离心，取上层清液保存到新编号的离心管中。使用低温真空离心机去甲醇溶剂后，加入550 μL磷酸缓冲溶液(0.1 M, 50%D2O, 0.1%NaN3, 0.001%TSP-d6)复溶。涡旋1 min，离心10 min，4 ℃ 12000 r/min。取500 μL上清液于5 mm标准核磁管中待测。

2.4 1H NMR检测

将上述处理好的样品分别利用NMR仪器进行数据检测，最后使用Bruker Biospin v2.1 workstation software (Bruker, Gremany) 对18个样本的1H NMR自由感应衰减(Free Induction Decay, FID)信号进行傅立叶转换，调整相位，校准基线，以TSP(δ0.00)为全部谱图化学位移的标准。对δ0.5～δ9.5范围内的谱峰进行对齐分析，按照0.01 ppm单位的化学位移宽度进行分段积分处理。为防止水峰残留信号的干扰，除去水峰压制区段(4.81～ 5.18 ppm)的分段积分值，同时去除部分样本中甲醇的信号峰干扰段(3.358～3.368ppm)。然后将每张谱图所有积分段的面积值进行归一化处理，且对不同样本完成体积归一化，导出包含873个分段及其对应积分面积值的数据矩阵。最后将数据矩阵导入在线软件MetaboAnalyst 4.0分析平台，实现可视化并进行多元统计分析。

3 结果

3.1 大鼠血清酶活性及心脏病理切片分析

3.1.1 血清酶影响 表2显示，与正常组比较，模型组CK、CK-MB、LDH酶的活性显著升高。与模型组比较，栝楼-薤白37.5 g/kg能降低血清CK、CK-MB、LDH酶的活性。

表2 栝楼-薤白对慢性心肌缺血大鼠血清CK、CK-MB、LDH活性影响比较

注：与正常组比较：P*<0.05，P**<0.01；与模型组比较：P△<0.05，P△△<0.01

3.1.2 心脏病理切片分析 图1显示，将大鼠心脏切片于光学显微镜下观察(×200)。结果显示，正常组细胞结构比较清晰，肌纤维排列整齐，肌浆染色均匀，细胞核居中，细胞间有一定的间隔，未见炎性细胞浸润和水肿情况。模型组细胞结构模糊，排列紊乱，有大量的炎细胞浸润，且细胞内可见大量空泡；细胞排列紧密，可见明显的水肿情况。栝楼-薤白组细胞结构清晰，心肌纤维排列整齐，肌浆染色均匀，细胞核居中，少量炎细胞浸润，细胞内未见明显空泡存在，与正常组非常接近，与模型组比较有较大差异。

图1 光镜下心肌组织切片(×200)

3.2 1H NMR谱图归属及多元统计分析

3.2.1 血清1H NMR谱图归属 图2～4表3显示，采集的1H NMR谱图中低场(δ5.18～9.50)信号较高场少，代谢物分布集中在δ2.0～δ5.0之间，在高场区域(δ0.0～δ4.8)中糖类物质的信号较强且堆叠而难辨识，一些有机酸类化合物信号的强度较低。本项目的所有信号归属根据谱图中实际信号的化学位移、耦合裂分、半峰宽以及峰形等信息进行判断，并结合evaluate版的Chenomx数据库和相应文献的参考情况进行归属指认。一共归属41种内源性代谢物，这些物质包括必须氨基酸苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸，非必须氨基酸甘氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺等，还有其他成分包括琥珀酸盐、3-羟基丁酸、肉碱和葡萄糖等。

图2 大鼠灌胃后血清NMR归属图δ0～δ3ppm

图3 大鼠灌胃后血清NMR归属图δ3～δ5ppm

图4 大鼠灌胃后血清NMR归属图δ5～δ8ppm

3.2.2 多元统计分析结果 图5显示，运用代谢组学在线分析软件Metaboanalyst 4.0平台对代谢物依次进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法分析(PLS-DA)，用以上统计分析方法反映2组间离散程度和寻找2组之间差异位点。PCA分析结果可以看出，模型组、栝楼-薤白组样本均在95%的置信区间内，未出现异常点。

图5 正常组(Z)与模型组(M)、栝楼-薤白组(Y)大鼠血清代谢物1H NMR的PCA得分图

图6、7显示，根据PLS-DA的VIP图和载荷图可以找到对样本具有重要作用以及它们在样本区分中贡献率较大的代谢物分析结果。由得分图6中显示，模型组和正常组样本明显分离，说明它们代谢轮廓相异，而组内样本团聚在一起，说明样本具有较高的重复性。在交叉验证(cross-validation, CV)中模型组与正常组结果显示,R2=0.998表示模型建立的准确度很高，而Q2=0.554表示模型稳定性好，预测能力高，过拟合风险低。

图6 正常组(Z)与模型组(M)大鼠血清代谢物1H NMR的PLS-DA得分图和VIP图及载荷图

图7 栝楼-薤白组(Y)与模型组(M)大鼠血清代谢物1H NMR的PLS-DA得分图和VIP图及载荷图

3.3 生物标志物的确定及差异分析

表3显示，根据核磁共振一维图谱标志物的化学位以及数据的多元统计分析结果，载荷图上距离原点越远代表代谢物对样本的贡献越大，再结合具有显著差异性(P<0.05)的和PLS-DA图中VIP >1的化合物以代谢物作为潜在生物标志物。在利用HMDB数据库确定代谢物的同时，还结合evaluate版的Chenomx数据库及相关文献[10]进行指认，代谢物名称以Chenomx数据库表述方式为依据。最终对慢性心肌缺血潜在生物标志物鉴定的结果及其含量变化趋势。

表3 生物标志物及其变化趋势比较

注：“↑”为代谢含量升高，“↓”为代谢含量降低，箭头数量为含量变化的幅度

慢性心肌缺血和栝楼-薤白治疗导致大鼠血清代谢物的含量发生变化。表3显示，与正常组比较，模型组大鼠缬氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺的含量降低，牛磺酸、琥珀酸、肌酸、3-羟基丁酸、肉碱的含量也降低，而脯氨酸、谷氨酸的含量未发生变化，但甜菜碱的含量却升高。与模型组比较，栝楼-薤白组中除甜菜碱含量未发生变化外，其他代谢物的含量均显著升高。

4 讨论

研究结果显示，慢性心肌缺血大鼠在栝楼-薤白治疗后代谢物发生了明显变化，主要影响的代谢途径有能量代谢、氨基酸代谢和胆碱代谢。

琥珀酸作为三羧酸循环中的重要产物之一，在模型组中含量显著下降，其消耗说明有氧糖酵解过程受到抑制。又由于心肌缺血时心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作，而心肌心脏活动所需要的能量几乎完全靠有氧代谢产生的三磷酸腺苷(ATP)提供，当ATP消耗殆尽时肌酸能够快速合成ATP，以供给心肌细胞正常的能量需求，参与体内的能量代谢，保证心肌的正常工作。

甜菜碱学名三甲基甘氨酸，可由甘氨酸在体内甲基化产生，最终可转化生成乙酰胆碱参与信息传导相关通路。表3显示，模型组中甘氨酸的含量明显下降，而甜菜碱含量升高，可见慢性心肌缺血大鼠体内很可能发生甘氨酸甲基化的过程，从而参与胆碱的代谢。

牛磺酸具有抑制血小板凝集与血栓形成、降低血脂、抗动脉粥样硬化、抗心律失常、抗心力衰竭、保护心肌等作用。大量临床资料证实，引起心肌损伤的多种因素均可使细胞内牛磺酸丢失，加速细胞受损[11]。在给药后，牛磺酸的含量显著升高，说明栝楼-薤白影响了牛磺酸的代谢，增加在血清中的含量从而修复受损的心肌细胞，达到治疗慢性心肌缺血的目的。薤白辛、温，与栝楼配伍通过胸中之阳气而达到治疗寒痰凝滞于胸中之胸痹心痛的作用，可能与牛磺酸的强心通阳有密切关系。由于牛磺酸与胱氨酸、半胱氨酸的代谢密切相关，而薤白中含有多种含硫化合物，这些化合物可能补充必要的硫元素而导致牛磺酸的含量升高，但其具体结果有待进一步的研究考证。

另外，前人已研究报道心血管类疾病与氨基酸的代谢异常相关[12]。模型组中谷氨酰胺的含量下降，使其合成受阻，导致谷胱甘肽的合成过程受阻。而谷胱甘肽的主要作用是保护细胞膜的完整性，故可知模型组中细胞膜的完整性受到损害。给药后，栝楼-薤白组的谷氨酰胺的含量升高，可以推测栝楼-薤白对细胞膜受损有修复作用，进一步保护心肌缺血过程。前人研究表明，在能量耗尽的心脏中，缬氨酸可以适当地保护心肌损伤[13]。此外，丝氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸的含量均有明显下降，可能合成酶和激素类物质保证机体的正常代谢，也可能发生脱氨基作用供给机体能量，但具体过程仍有待进一步研究。肉碱和3-羟基丁酸的含量变化表明，栝楼-薤白对慢性心肌缺血的治疗还涉及到脂类代谢过程。

通过以上对相应代谢物含量变化分析，栝楼-薤白煎液可能主要是通过影响机体能量代谢、氨基酸代谢和胆碱代谢等相关通路来调节相关代谢物的含量，从而达到保护慢性心肌缺血的目的，但其具体的代谢通路仍有待进一步的研究确认。