李子义 贺子航 卢惠君 王玉成 及晓宇

(东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室,哈尔滨 150040)

土壤盐渍化严重限制了植物正常生长，是全球农林业发展的一个重要问题。植物通过信号传导途径调控基因表达来响应盐胁迫[1]，随着分子开关控制应激反应基因的表达，转录因子在调节各种非生物胁迫应激反应中起着至关重要的作用。因此，研究转录因子所调控的基因表达网络并筛选出抗逆能力优良的基因，进而培育良种，具有重要的生态、社会意义[2]。

bHLH转录因子是植物第二大类转录因子家族[3]，包含N端碱性区域和C端螺旋—环—螺旋区域两个结构域[4～5]，其主要通过参与复杂的信号通路来调控下游基因的表达[6]，进而调节植物各种生理生化反应及生长发育过程[7]。到目前为止，研究者在水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)和小麦(Triticumaestivum)基因组中共鉴定出183，231和571种bHLH转录因子，与拟南芥(Arabidopsisthaliana)的1 154个bHLH转录因子被分为36个亚科[8]。已有部分植物bHLH转录因子的功能被鉴定出来，如烟草(Nicotianatabacum)NtbHLH123、小麦TabHLH1及拟南芥AtbHLH18，AtbHLH34和AtbHLH115等[9～13]，而在拟南芥中还有许多bHLH转录因子功能亟待鉴定。

bHLH转录因子家族成员在植物生长发育、生理代谢中起重要作用[6]。例如，在烟草中，NtbHLH93主要在生育期侧根和盛花期子房组织中高表达[14]。在番茄(Solanumlycopersicum)中，SlbHLH22诱导表达细胞壁代谢相关基因(SlEXP1，SlLoxA，SlMAN，SlPE和SlXTH5)，过表达SlbHLH22番茄果实较野生型成熟快[3]。PREs(Paclobutrazol Resistances)参与调节植物对赤霉素、油菜素类固醇和生长素(IAA)等几种不同植物激素的反应[15]。bHLH转录因子MYC2是茉莉酸(JA)信号通路的重要调节因子，在苹果(Malusdomestica)中花青素生物合成基因MdDFR，MdUF3GT，MdF3H和MdCHS的转录水平在过表达MdMYC2愈伤组织中显著上调,使过表达的愈伤组织产生更多的花青素[16]。

不仅如此，bHLH转录因子在非生物胁迫响应过程中也起到重要作用[17]。许多研究表明过表达bHLH基因增强了植物对盐、干旱、冷冻及氧化胁迫的耐受性[4,18～20]。过表达AtbHLH104拟南芥增强了其镉(Cd)胁迫耐受性[21]，bHLH104转录因子正调节四种重金属解毒相关基因(IREG2，MTP3，HMA3和NAS4)，这些基因在Cd螯合和耐受中起作用。在烟草中过表达穇子(Eleusinecoracana)EcbHLH57基因显著提高了其对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性。过表达EcbHLH57烟草在干旱胁迫下，表现出较高的光合速率和气孔导度；在盐胁迫下，积累较高的种子重量和荚果数，从而提高了烟草的耐盐抗旱功能[22]。在水稻中，盐胁迫下过表达OsbHLH068降低了水稻H2O2的积累，促进了根系的伸长，保持水分来抵抗胁迫[23]；OsbHLH062介导的转录激活调控盐胁迫耐受相关基因的表达，从而发挥转录调控作用，增强水稻的耐盐能力[24]。上述研究表明bHLH转录因子在响应非生物胁迫的过程中起关键作用。

拟南芥bHLH蛋白Ⅺ亚家族共有五个成员，包括bHLH7(AT1G03040)、bHLH82(AT5G58010)、bHLH69(AT4G30980)、bHLH59(AT4G02590)及bHLH66(AT2G24260)[25]，本研究中AtUNE12基因(AT4G02590)属于该亚家族。据已有研究，发现bHLH蛋白Ⅺ亚家族中bHLH69基因[26]与bHLH82基因[27]响应非生物胁迫，我们推测该亚家族其他基因也可能具有抗逆功能，因此，本研究拟对AtUNE12基因的耐盐功能进行鉴定，以期为进一步探究bHLH转录因子响应非生物胁迫的调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

哥伦比亚野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)：生态型Columbia(Col-0)其种子由东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室保存。

将拟南芥种子播种于蛭石、珍珠岩及黑土(体积比为3∶1∶1)的混合土中，置于温度为22±2℃，相对湿度为65%～75%，光照强度为400 μmol·m-2·s-1，光周期为16 h光照/8 h黑暗的人工培养室培养。

1.2 质粒与菌株

植物表达载体pROKⅡ、大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α及根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105均由东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室保存。

1.3 拟南芥总RNA的提取与cDNA第一链的合成

选取4周苗龄的拟南芥植株，利用TRIzol法[28]，进行总RNA的提取。参照PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)试剂盒说明合成cDNA第一链以备用。

1.4 AtUNE12基因的克隆

根据AtUNE12基因序列，利用Primer Premier 5.0设计克隆引物AtUNE12-F和AtUNE12-R(表1)，以合成的拟南芥cDNA为模板，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，将获得的克隆片段与pMD18-T(TaKaRa)载体连接，转化大肠杆菌后测序鉴定。

1.5 多序列比对及系统进化树分析

利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)网站进行BlastP检索，获得与拟南芥AtUNE12基因同源性较高的12个不同物种的bHLH氨基酸序列，利用BioEdit软件进行多序列比对，并利用MEGA6.0软件，使用邻位归并法(Neighbor-joining)进行系统进化树分析。

1.6 AtUNE12基因植物过表达载体的构建与转基因拟南芥的获得

利用Primer Premier 5.0设计引物pROKⅡ-AtUNE12-F和pROKⅡ-AtUNE12-R(表1)，引入SmaⅠ酶切位点，用SmaⅠ(NEB)线性化pROKⅡ载体质粒，将克隆获得的AtUNE12基因与线性化pROKⅡ载体进行同源融合(Infusion)，转化大肠杆菌并测序验证，结果与原序列比对正确之后提取重组pROKⅡ-AtUNE12载体质粒，将其转入EHA105农杆菌中，利用浸花法[29]获得转基因拟南芥。对转基因拟南芥进行DNA提取[30]，用pROKⅡ载体引物进行PCR，电泳检验，并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术进行检测，利用2-ΔΔCt法进行基因的相对表达量分析[31]，最终获得T3代转基因拟南芥。

表1 引物序列

1.7 转基因拟南芥的根长、鲜重测定分析

将过表达AtUNE12拟南芥T3代纯合株系与对照拟南芥种子平铺于1/2 MS培养基上，待种子萌发5 d后，分别转移至1/2 MS和含有150 mmol·L-1NaCl的1/2 MS培养基平板上，在人工培养室直立培养7 d后观察各植株的长势，测定其根长及鲜重并拍照，数据使用SPSS18.0进行统计分析。

1.8 拟南芥耐盐生理生化指标测定

将4周苗龄的过表达AtUNE12拟南芥T3代纯合株系与对照拟南芥植株的土培苗用150 mmol·L-1NaCl溶液进行胁迫处理，分别取胁迫处理的过表达AtUNE12与对照拟南芥植株(3次生物学重复)，测定植株的过氧化物酶(POD)与超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢(H2O2)含量、电解质渗透率、丙二醛(MDA)含量及失水率(失水率分别在胁迫0.5、1、2、3、4及5 h进行测定)，方法参照植物基因工程实验技术指南[32]，数据使用SPSS 18.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 AtUNE12基因多序列比对及系统进化树分析

AtUNE12基因的开放阅读框为933 bp，编码310个氨基酸。在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)网站上对其编码的氨基酸序列进行同源搜索BLAST，发现AtUNE12与枣ZjbHLH和番木瓜CpbHLH的相似性高达99%。通过多序列比对及系统进化树分析其氨基酸序列与其他12个物种的bHLH蛋白的相似性，多序列比对结果显示，AtUNE12具有bHLH家族典型的序列特征(图1A)。系统进化树结果显示，AtUNE12与EsbHLH蛋白的亲缘关系较近，推测二者可能具有相似的功能(图1B)。

2.2 AtUNE12基因的克隆及pROKⅡ-AtUNE12载体验证

以合成的拟南芥cDNA为模板，用克隆引物AtUNE12-F和AtUNE12-R进行PCR，克隆获得AtUNE12基因(图2A)。将AtUNE12基因与pROKⅡ载体连接后，利用pROKⅡ载体引物pROKⅡ-F和pROKⅡ-R(表1)进行PCR检查，电泳结果显示AtUNE12基因已成功构建到pROKⅡ载体中(图2B)。

2.3 转AtUNE12基因拟南芥的检测

提取T3代9个株系转AtUNE12基因拟南芥的DNA[30]，用AtUNE12基因克隆引物进行PCR，琼脂糖凝胶电泳检测(图3A)；对过表达AtUNE12拟南芥植株进行RNA提取，利用qRT-PCR技术检测9个株系中AtUNE12的相对表达量，结果表明AtUNE12基因已成功转入拟南芥(图3A)，并且OE3与OE7株系中AtUNE12基因的表达量较其他株系高(图3B)。因此，选择OE3和OE7过表达株系进行后续的耐盐功能分析。

图1 AtUNE12多序列比对及系统进化树分析 A.多序列比对黑框表示bHLH家族的2个保守结构域；B.系统进化树百分数表示自展值 EsbHLH.山萮菜(XP_006396471.1)；CrbHLH.荠菜(XP_023637045.1)；CsbHLH.亚麻荠(XP_010456011.1)；ThbHLH.醉蝶花(XP_010556765.1)；CpbHLH.番木瓜(XP_021898025.1)；ZjbHLH.枣(XP_015891470.1)；TcbHLH.可可树(XP_017983588.1)；RcbHLH.蓖麻(XP_002520976.1)；GmbHLH.大豆(XP_003554277.1)；SsbHLH.密花豆(TKY62402.1)；QsbHLH.欧洲栓皮栎(XP_023886707.1)；CcbHLH.木豆(XP_020227636.1)Fig.1 Multiple sequence alignment and phylogenetic tree analysis of AtUNE12 A.Multiple sequence alignment black boxes indicate two conserved domains of the bHLH family；B.Phylogenetic tree percentage indicate bootstrap values EsbHLH.Eutrema salsugineum；CrbHLH.Capsella rubella；CsbHLH.Camelina sativa；ThbHLH.Tarenaya hassleriana；CpbHLH.Carica papaya；ZjbHLH.Ziziphus jujuba；TcbHLH.Theobroma cacao；RcbHLH.Ricinus communis；GmbHLH.Glycine max；SsbHLH.Spatholobus suberectus；QsbHLH.Quercus suber；CcbHLH.Cajanus cajan

图2 AtUNE12基因克隆及pROKⅡ-AtUNE12载体验证结果 A.基因克隆验证；B.载体构建验证；M.DL2000 MarkerFig.2 The results of AtUNE12 gene cloning and pROKII-AtUNE12 vector verification A.Verification of gene cloning; B.Verification of vector construction; M.DL2000 Marker

2.4 过表达AtUNE12基因与野生型拟南芥的根长、鲜重测定结果

在盐胁迫下，观察过表达AtUNE12与野生型拟南芥植株长势，统计根长及鲜重数据，拍照。结果表明：盐胁迫下，过表达株系(OE3和OE7)的根长及鲜重显著高于野生型(Col-0)植株(图4)，说明过表达AtUNE12基因显著提高了拟南芥植株的耐盐能力。

2.5 过表达AtUNE12基因与野生型拟南芥植株的MDA含量、电解质渗透率及失水率分析

MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，通过MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接说明膜系统受损程度及植物的抗逆性。分别取盐胁迫处理的过表达AtUNE12基因与对照拟南芥植株叶片进行MDA含量测定(3次重复)。结果表明：在正常生长条件下，过表达AtUNE12基因(OE3和OE7)及野生型(Col-0)拟南芥植株的MDA含量无明显差异；而在盐胁迫条件下，过表达AtUNE12基因拟南芥的MDA含量明显低于野生型拟南芥(图5A)。

电解质渗透率是反应细胞膜受损情况与程度的重要生理指标之一，电解质外渗越多，说明植物受损伤越严重。分别取盐胁迫处理的过表达AtUNE12基因与对照拟南芥植株叶片进行电解质渗透率测定(3次重复)。结果表明：在正常生长条件下，过表达AtUNE12基因及野生型拟南芥植株电解质渗透率无明显差异；而在盐胁迫条件下，过表达AtUNE12基因拟南芥的电解质渗透率明显低于野生型拟南芥(图5B)。

植物离体叶片失水率是研究植物抗逆的重要生理指标之一，一般情况下，植物的抗逆性与离体叶片失水状况成负相关。分别取过表达AtUNE12基因与对照拟南芥植株叶片进行失水率测定(3次重复)，结果表明：过表达AtUNE12基因及野生型拟南芥植株0.5 h内失水率没有明显的变化；1～5 h内，过表达AtUNE12基因及野生型拟南芥植株的失水率差距逐渐增大，其中OE3的失水率最低(图5C)。上述结果说明过表达AtUNE12基因显著降低了盐胁迫下拟南芥的电解质渗透率，MDA含量及失水率，保护细胞膜结构的完整性，从而增加拟南芥的耐盐能力。

图3 T3代过表达AtUNE12拟南芥的检测结果 M.DL2000 Marker; OE1～OE9.T3代AtUNE12基因过表达株系1～9；+.阳性对照；-.阴性对照Fig.3 Identification of Arabidopsis thaliana with overexpression of AtUNE12 M.DL2000 Marker; OE1-OE9.Overexpression AtUNE12 gene of T3 generation strain 1-9; +.Positive control; -.Negative control

图4 盐胁迫下过表达AtUNE12及野生型拟南芥的长势分析Fig.4 Growth analysis of OE and Col-0 A.thaliana under salt stress

图5 盐胁迫下过表达AtUNE12及野生型拟南芥MDA含量、电解质渗透率及失水率分析Fig.5 MDA contents,Electrolyte leakage and water loss rates in OE and Col-0 A.thaliana under salt stress

2.6 过表达AtUNE12基因与野生型拟南芥植株POD、SOD活性及H2O2含量测定

POD与SOD能清除植物在胁迫过程中产生的有害物质，探究POD与SOD活性以反映植物抗逆能力。分别取盐胁迫后的过表达AtUNE12基因及对照拟南芥植株进行POD与SOD活性测定(3次重复)。结果表明：正常生长条件下，过表达AtUNE12基因(OE3和OE7)及野生型(Col-0)拟南芥POD、SOD活性无明显差异；而盐胁迫下，过表达AtUNE12基因拟南芥的POD、SOD活性要显著高于野生型拟南芥(图6:A，B)。上述结果表明AtUNE12基因在拟南芥中正向调控POD和SOD活性，增强了拟南芥的ROS清除能力，进而提高了拟南芥的耐盐功能。

测定过表达AtUNE12基因与对照拟南芥植株内的H2O2含量变化，以分析其活性氧(ROS)水平。分别取盐胁迫过表达AtUNE12基因及对照拟南芥叶片测定H2O2含量(3次重复)，结果表明：在正常生长条件下，H2O2含量在过表达AtUNE12基因(OE3和OE7)及野生型(Col-0)拟南芥中基本一致；而在盐胁迫下，过表达AtUNE12基因拟南芥的H2O2含量明显低于野生型拟南芥(图6C)。上述结果表明过表达AtUNE12基因能够降低拟南芥植株内H2O2的含量，进而降低ROS的积累。

图6 盐胁迫下过表达AtUNE12及野生型拟南芥植株ROS水平及POD、SOD活性分析Fig.6 Analysis of ROS accumulation and the activities of POD and SOD in OE,Col-0 A.thaliana under salt stress

3 讨论

本研究选取拟南芥bHLH转录因子家族的AtUNE12基因进行耐盐功能分析。通过浸花法获得了AtUNE12基因过表达拟南芥，利用qRT-PCR技术选出AtUNE12基因相对表达量较高的OE3和OE7株系，用于后续耐盐能力的分析。分别对AtUNE12基因过表达及野生型拟南芥植株的根长、鲜重及耐盐生理指标进行测定。在盐胁迫下，发现过表达AtUNE12基因拟南芥的根长、鲜重及长势显著优于野生型，为了进一步验证AtUNE12基因的耐盐功能，在盐胁迫下，AtUNE12基因的过表达降低拟南芥植株的电解质渗透率、MDA含量及失水率，减轻细胞损伤，进而增加拟南芥的耐盐能力。通过POD和SOD活性及H2O2含量测定，来检验拟南芥体内的ROS水平。在盐胁迫下，过表达AtUNE12植株的POD、SOD活性要显著高于野生型植株，H2O2含量明显低于野生型。因此，我们推断在盐胁迫下，AtUNE12基因的过表达能够影响相关调控POD、SOD酶活的基因，进而提高了拟南芥ROS清除能力。

大量的研究表明bHLH转录因子基因能提高植物对非生物胁迫的耐受性。过表达刚毛柽柳(Tamarixhispida)ThbHLH1基因通过增强ROS清除能力，提高了转基因拟南芥及刚毛柽柳的耐盐和抗旱能力[33]。将AtUNE12基因进行blast比对，结果发现其与ThbHLH1基因具有较高的同源性。NtbHLH123基因在烟草中过量表达，参与胁迫相关基因的表达调控，能够正向调节烟草的ROS清除能力；与此同时降低了植株电解质渗透率及MDA含量，来减轻细胞损伤程度，进而增强烟草非生物胁迫耐受性[34]。ZmbHLH105基因响应逆境胁迫调控，锰(Mn)/铁(Fe)相关转运蛋白的表达，通过增强ROS清除能力，提高玉米非生物胁迫耐受性[35]。甜橙(Citrussinensis)中CsbHLH18基因在烟草中过量表达，通过减少植株ROS的积累增强其耐寒性[36]。在低温胁迫下，过表达PubHLH1的山梨(Pyrusussuriensis)品系较野生型具有更高的存活率，更低的电解质渗透率及MDA含量。转基因品系较野生型的ROS清除水平更高[37]。在盐、干旱胁迫下，过表达TabHLH1的小麦品系体内SOD、POD的活性较野生型显著增强；在渗透胁迫条件下，H2O2含量明显减少，表明TabHLH1响应非生物胁迫，增强ROS清除水平，提高小麦非生物胁迫耐受性[12～13]。在拟南芥中，AtbHLH112通过与GCG-Box或E-Box结合调节基因的表达，提高ROS的清除能力，以增强拟南芥非生物胁迫耐受性[38]。

上述研究表明，bHLH转录因子基因能够介导增强ROS清除能力与减轻细胞损伤程度来提高植物对非生物胁迫的耐受性。这与本研究中过表达AtUNE12基因提高拟南芥耐盐能力的结果相符。本研究丰富了bHLH转录子家族抗逆基因功能研究的成果，为进一步系统阐述bHLH转录因子响应非生物胁迫的调控机制奠定了基础。

4 结论

本研究克隆了bHLH转录因子家族中的AtUNE12基因并构建其过表达载体，获得了T3代过表达AtUNE12基因拟南芥。AtUNE12基因正向调控POD与SOD酶的活性，过表达AtUNE12基因增强了拟南芥的ROS清除能力，减少细胞受损程度，进而提高了拟南芥的耐盐能力。