郑旋 向准 康超 李鹏 汪建文 杨彝华

摘 要 对贵州省龙里县羊肚菌开展真菌病害调查、采集与分离纯化，运用形态学鉴定和rDNA-ITS序列分子检测法构建系统发育树。共分离鉴定了18个真菌病原菌菌株，属于木霉属（Trichoderma）、毛霉属（Mucor）、根霉属（Rhizopus）、镰刀菌属（Fusarium）和阿太菌属（Athelia）等。

关键词 羊肚菌;真菌病害;分离鉴定

中图分类号：S567.34 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.21.066

羊肚菌（Morchella importuna）隶属于羊肚菌科（Morchellaceae）羊肚菌属（Morchella）[1]，因其菌盖表面凹凸不平形似羊肚，又被称为羊肚菜、羊肚蘑，是一种珍贵食药用菌[2]。近年来，随着羊肚菌产业的扩大发展，栽培管理中病虫害问题日趋明显[3]，其中由真菌病原菌引发的竞争（侵染）性病害最为严重，造成羊肚菌减产甚至失收[4]。本研究通过羊肚菌真菌病害调查和分离鉴定，了解羊肚菌真菌病害发生情况和病原菌类别，为羊肚菌防治病害提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2020年1月，在贵州省龙里县湾滩河镇羊肚菌种植基地开展真菌病害调查，以3～5个大棚为调查重点，每个大棚随机采集有明显真菌病害特征的羊肚菌子实体、营养袋和栽培土壤标本，记录发病时间和病害特征等信息，标本编号并装入密封袋内，迅速带回实验室进行分离、培养、鉴定。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离、纯化

在超净工作台上，用灭菌过的接种针从样品病害部位挑取1小块置于PDA培养基平板上，于25 ℃恒温避光培养3～5 d，挑取菌落尖端菌丝于PDA培养基上培养，重复3～5次。将纯化后的菌丝转入斜面试管培养，于

4 ℃冰箱内保存。

1.2.2 病原菌形态鉴定

在超净工作台上，用灭过菌的接种针从保存的病原菌株上各挑取少量菌丝，分别接种于PDA平板培养基上，置于25 ℃恒温培养箱中培养。每隔1 d观察菌落形态和菌丝生长情况等。

1.2.3 病原菌分子鑒定

采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取病原菌菌株DNA，用引物5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3和5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3扩增菌株DNA基因的ITS序列，PCR反应采用25 μL反应体系。PCR循环条件为：94 ℃预变性4 min;扩增30个循环（94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min），72 ℃延伸10 min。测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，测序结果在GenBank数据库中进行Blast比对分析。

2 结果与分析

2.1 羊肚菌真菌病害调查

在调查的羊肚菌栽培大棚内，共采集病害样品9份，病害特征调查结果为：羊肚菌子实体颜色变深，不同程度萎蔫、畸形，蛛网状白色菌丝自下而上侵染，包裹整个子实体，幼菇停止发育;菌柄颜色偏红，菌盖畸形发育呈近圆球形，顶部有白色霉层，并产生白色孢子粉;菌盖萎蔫形成孔洞，孔洞边缘有白色霉层。营养袋内有粉红色至紫色、绿色黑色霉菌污染。白色病菌菌丝自菌袋底部向周围土壤侵染蔓延，覆盖营养袋周围栽培土壤，后期菌丝侵染整个厢面，颜色加深，厢面上无羊肚菌生长。

2.2 病原菌菌落形态特征

分离纯化采集的9份病害样品，共获得18个真菌病原菌菌株，分别对18个真菌病原菌菌株进行菌落形态特征观测，结果如图1所示。

2.3 病原菌分子鉴定及系统发育树

将18个真菌病原菌菌株的ITS序列在GenBank中进行Blast序列分析

3 讨论

调查显示，因栽培土壤处理不当或培养料灭菌不彻底，真菌在适宜环境下迅速生长，与羊肚菌菌丝争夺营养、水分、氧气和空间，导致羊肚菌子实体生长不良或停止生长[5-6]。其中，深绿木霉（T.atroviride）和绿木霉（T.virens）为常见食用菌栽培中的木霉杂菌，总状毛霉（M.racemosus）为常见的食用菌栽培中的毛霉杂菌，尖孢镰刀菌（F.oxysporum）和亚洲镰刀菌（F.asiaticum）可能为羊肚菌镰刀菌病或霉菌性枯萎病的病原菌[7-8]。在羊肚菌栽培过程中，土壤表面出现大量白色菌丝，可能为阿太菌，梨采后阿太菌易发，此次是首次从食用菌病害中分离得到的[6]，在食用菌上还未见其致病报道，对所得结果还需进一步验证。

参考文献：

[1] 吴兴亮，卯晓岚，图力古尔，等.中国药用真菌[M].北京：科学出版社，2013.

[2] 敬华英.羊肚菌种属鉴定及活性成分保健功效研究进展[J].安徽农业科学，2018，46（14）：34-36.

[3] 刘伟，张亚，何培新.羊肚菌生物学与栽培技术[M].长春：吉林科学技术出版社，2017.

[4] 宋金俤，曲绍轩，马林，等.食用菌病虫识别与防治原色图谱[M].北京：中国农业出版社，2013.

[5] 刘正慧，李丹，等.食用菌主要病原真菌和细菌[J].菌物研究，2018，16（3）：158-163.

[6] 贾晓辉.梨采后阿太菌果腐病病原学及其致病机制研究[D].沈阳：沈阳农业大学，2019.

[7] 吴小平.食用菌致病木霉的鉴定、致病机理及防治研究[D].福州：福建农林大学，2008.

[8] 余苗，尹琪，何培新.羊肚菌白腐病病原菌的分离与鉴定[J].北方园艺，2020（7）：142-145.

（责任编辑：刘昀）