,2,2,2,2,2,2,2,2,*

(1.大连工业大学食品学院,辽宁大连 116034; 2.国家海洋食品工程技术研究中心,辽宁大连 116034)

酸鱼是我国苗族、侗族等少数民族一种独有的传统佳肴,是华南地区的传统发酵鱼产品之一。酸鱼不仅酸香浓郁、风味独特、回味醇厚、贮藏期长,而且营养丰富,蛋白含量高,富含多种游离氨基酸,且脂肪含量低,因此深受人们的青睐,在我国、日本及东南亚等地具有很大的需求市场[1]。它主要由淡水鱼、鲤鱼或草鱼与米饭或其他谷物、盐和香料混合发酵而成[2],可炒食或放上辣椒煮成酸辣汤,味道鲜嫩爽口,使人食欲倍增。酸鱼的制作以家庭作坊式的传统工艺为主,一般分为小米发酵和辣椒发酵。发酵不仅可以去除鱼肉的腥味、异味,还能赋予其特殊的风味[3]。传统的加工方式使得酸鱼的发酵周期长,工艺关键参数等的描述较为模糊,我国传统固态发酵鱼制品因地域、民族、加工方式不同而产生口味各异的品种[4]。利用植物乳杆菌发酵经过发酵的鱼肉中庚醛、己醛、1-辛烯-3-醇等具有腥味的物质减少,具有奶香气味的己酸、2,3-丁二酮、乙偶姻等物质含量增加[5]。Zeng等[6]在酸鱼中接种发酵剂的发酵鱼中乙醇和乙酸含量高于对照组,可以产生独特的葡萄酒风味和适度的酸味,生成高含量的己醛。Lee等[7]在韩国鱼酱中发现四联球菌属与风味有很大的联系。目前,由于原料特性及民族风俗习惯的不同,发酵过程中微生物对发酵鱼制品中风味物质的提升具有一定的影响。但对于不同市售酸鱼产品的风味物质与微生物之间的相关性比较研究报道较少。

为研究酸鱼中微生物群落对风味的影响,选择具有代表性的2个省份(贵州、湖南)共8种样品进行相关的指标分析,通过比较不同酸鱼pH、乳酸、游离氨基酸及生物胺,并探究酸鱼微生物群落的分布情况,采用顶空固相微萃取技术对不同酸鱼产品的挥发性物质进行分析,分析微生物多样性以及风味物质与微生物之间的相关性。该研究对品质评价和质量控制具有一定的科学依据,对发现优良发酵剂以及改善酸鱼品质有一定的促进作用,为酸鱼产品合理选择提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

8个样品 分别产于贵州、湖南两省的不同产品,购自淘宝商家,样品信息如表1所示;乳酸 生化试剂,上海生工生物工程有限公司;甲酸、三氯乙酸、乙酸铵、氨水、碳酸钠、碳酸氢钠 色谱纯,美国阿拉丁工业公司;衍生缓冲液、平衡缓冲液 分析纯,大连依利特分析仪器有限公司;甲醇 色谱纯,上海麦克林生化科技有限公司;乙腈 色谱纯,美国Spectrum化学试剂公司。

表1 不同酸鱼产品的信息Table 1 Information on different products of Suanyu

FE28台式pH计 梅特勒-托利有限公司;匀浆机 IKA;ICS5000型离子色谱仪 Thermo Fisher Scientific;4000QTRAP型液相色谱质谱联用仪、7890A/5975C型气相色谱质谱联用仪 Agilent Technologiesc。

1.2 实验方法

1.2.1 酸鱼pH的测定 pH测定参考王利娟等[8]方法。

1.2.2 酸鱼乳酸的测定 乳酸测定参照牟豪杰等[9]方法,采用离子色谱测定。

1.2.3 酸鱼生物胺含量分析 参考Zeng等[10]的方法通过液相色谱质谱联用测定。

1.2.4 游离氨基酸及的滋味活度值(TAV)测定

1.2.4.1 游离氨基酸的测定 参照李燕等[11]的方法采用高效液相色谱法测定。

1.2.4.2 TAV的测定 TAV法是一种基于阈值水平综合评价滋味物质对食品整体贡献的经典方法。滋味强度值为滋味物质浓度与该物质阈值的比值。

1.2.5 挥发性成分分析

1.2.5.1 前处理 准确称取2.0 g鱼肉样品,蒸熟后捣碎放入20 mL顶空萃取瓶中,加入内标(50 μL,50 mg/mL环己酮)。密封后60 ℃水浴30 min,然后将萃取头插入,吸附40 min后取出萃取头,插入进样口250 ℃解析5 min。

1.2.5.2 色谱条件 色谱柱为HP-5MS毛细管色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm)。升温程序为30 ℃保持1 min,以4 ℃/min升至92 ℃,保持2 min;5 ℃/min升至200 ℃;0 ℃/min,6 ℃/min升至240 ℃,保持6 min;载气流速(He)为1.5 mL/min;不分流模式进样。

1.2.5.3 质谱条件 离子电离源,能量 70 eV;离子源温度 230 ℃;四极杆温度150 ℃。采集模式为全扫描,扫描范围40～400 u。

1.2.5.4 香气活性值(OAV) OAV 用于评价各香气物质对酸鱼香气的贡献,香气活性值为香气成分的含量与阈值的比值。

1.2.6 酸鱼微生物分析 将8 g酸鱼样品剪碎装入10 mL试管中,保存在-80 ℃。送百迈客生物科技有限公司提取基因组并测序。利用Illumina Hiseq测序平台对样品的基因组进行测序,得到原始数据。

1.3 数据处理

运用Canoco for windows 4.5进行冗余分析(RDA),采用Excel、SPSS 18.0进行数据处理。所有样品均平行测定3次,采用ANOVA进行差异显著性分析,以P<0.05为显著。

2 结果与分析

2.1 不同酸鱼产品pH、乳酸分析

表2 不同酸鱼产品中生物胺含量Table 2 Biogenic amine content of different Suanyu products

注：同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05),表3同。

对8种酸鱼产品进行pH、乳酸指标的测定,结果见图1。图1A中不同酸鱼产品的pH范围在4.30～6.20之间,呈酸性的原因可能是碳水化合物的利用和随后由细菌生产的有机酸,如乳酸[12]。pH呈现不同差异这可能是由于原料鱼肉本身的pH可能存在差异。低pH通常被认为是保障发酵食品安全的一个重要因素[13]。Zeng等[14]在发酵低盐酸鲊鱼中的pH范围在4.00～6.70。图1B中不同样品乳酸含量各不相同,差异较为显著,含量在1.35%～3.74%。在本研究中乳酸积累量的不同可能是由于发酵条件或原料自身携带细菌的差异,使得发酵过程中乳酸菌的生长情况各异,从而产生不同含量的乳酸。

图1 不同酸鱼产品pH及乳酸含量Fig.1 pH value and lactic acidcontent of different Suanyu products注:不同小写字母代表差异显著(P<0.05);数字“1～8”表示来自不同酸鱼样品的编号,图2～图4、表2～表5同。

2.2 不同酸鱼产品生物胺含量分析

食品中的生物胺主要通过微生物脱羧酶的作用生成含氮化合物[15]。过量摄入时引起人体产生头痛、血压不稳、呼吸紊乱等不良反应,直至发生中毒[16]。表2为不同产地酸鱼生物胺含量。可以看出在8种酸鱼产品中共检测到6种生物胺,分别是组胺、酪胺、尸胺、腐胺、色胺以及β-苯乙胺。有研究表明,人体摄入生物胺总量超过1000 mg/kg时会严重危害健康[17],本实验2号酸鱼中总生物胺的含量为447.33 mg/kg。其余7种产品的生物胺均低于200 mg/kg。7号中检测出含量最少(13.91 mg/kg),远低于危害人体健康的生物胺总含量,可能是由于原料肉中缺少了能够产生氨基酸脱羧酶的微生物,导致生物胺的含量较少。酪胺和组胺是发酵鱼制品中常见的生物胺[18]。酪胺的有毒剂量为100～800 mg/kg[19]。美国 FDA 要求进口海产品中组胺含量不得超过50 mg/kg[20]。在所有的样品中检测到酪胺的含量均低于224.56 mg/kg。8种样品中的组胺最高为13.23 mg/kg。尸胺方面,购买的8种发酵酸鱼中检出3号样品含量最高,为48.40 mg/kg,其含量远低于Rabie等[21]在发酵鱼肉中检测的尸胺含量超过了200 mg/kg。综上所述,检测到酸鱼样品中生物胺含量最高为447.33 mg/kg,最低为13.91 mg/kg,8种市售酸鱼总量,酪胺及组胺含量均在安全范围内,且尸胺含量远低于同类别发酵食品中含量。

2.3 不同酸鱼产品游离氨基酸分析

不同酸鱼产品的游离氨基酸含量及呈味特性见表3,共检出18 种游离氨基酸,种类较丰富。在8种市售酸鱼氨基酸总量均超过2000 mg/kg,具有显著性差异,2号样品含量最高为12905.79 mg/kg。酸鱼都存在必需氨基酸(6种):赖氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸。谷氨酸和天冬氨酸是很重要的鲜味物质,其含量是影响产品最终风味的重要依据[22]。呈鲜味谷氨酸方面,大于一半的酸鱼样品谷氨酸含量范围为75.19～143.68 mg/kg,贵州产地的4号样品含量最高(326.86 mg/kg),其次为6号。呈鲜味天冬氨酸方面,来自贵州产地的6号样品含量最高,为54.57 mg/kg,8号样品次之。

酸鱼呈味特性除了与氨基酸的含量有关,还和滋味活度值有直接联系,其值越大贡献越大,反之亦然。呈味强度值大于 1,表明该氨基酸对酸鱼滋味有显著贡献;呈味强度值小于 1,表明该味道不能被人体感知。由表4可知,在8种酸鱼样品中,2号样品中7种氨基酸TAV大于1,其个数最多,说明2号中具滋味贡献的氨基酸种类最多。呈鲜味天冬氨酸(Asp)在6号样品中TAV值最高(0.05),呈鲜味谷氨酸(Glu)在4号样品中TAV值最高(1.09),表明4,6号样品中鲜味氨基酸对滋味的贡献程度较大。

表3 不同酸鱼产品游离氨基酸含量Table 3 Free amino acid contents of different Suanyu products

注：“-”表示未检测到,表4～表5同。

表4 不同酸鱼产品游离氨基酸的TAV值Table 4 TAV values of free amino acids of different Suanyu products

注：“阈值”是指在水溶液中的阈值。

2.4 不同酸鱼产品挥发性风味物质分析

为了解酸鱼的风味特点,对8种酸鱼样品进行挥发性物质分析。如图2,8种样品共检出59种挥发性风味物质,包括醛类(6种)、酮类(3种)、醇类(16种)、酯类(10种)、酚类(3种、烃类(10种),表明市售8种酸鱼产品挥发性风味较丰富。总含量来看,贵州产地的8号酸鱼检测到的风味物质更多一些。不同酸鱼产品中各类挥发性风味物质相对含量各异(图2),1号样品中醛类物质为主导(61.2%),2、5、7号样品中醇类物质均占主导,分别为44.9%、89.7%、77.8%。3、6、8号样品中烃类物质占比最多,分别为43.8%、40.5%、45.3%,这一结果可能与发酵条件有关。醇类、醛类、烃类是酸鱼产品中主要的风味物质。

表5 不同酸鱼产品风味物质OAV值Table 5 OAV values of volatile compounds for different Suanyu products

图2 不同酸鱼产品各类挥发性风味物质相对含量对比及风味总量Fig.2 Comparison of relative content and flavor ofvarious volatile flavors of different Suanyu products

为了进一步明确市售不同酸鱼产品中贡献性挥发性风味物质,采用香气活性值(OAV)进行评价。香气化合物的OAV越大,说明其对整体香气贡献越大。表5是8种酸鱼中挥发性物质OAV值表,共确定了25种挥发性化合物的OAV。将OAV>100作为挑选酸鱼关键性风味物质的依据[25]。3-甲基-1-丁醇具有芳香气味[26],庚醛呈清甜味[27],γ-松油烯呈松油、铁锈味[28],作为小茴香的主要成分之一,它们可赋予产品独特的香味。3-甲基-1-丁醇的OAV均大于10000,庚醛OAV均大于100,除7号(OAV=85.23)γ-松油烯在其余样品中OAV>300,说明3-甲基-1-丁醇、庚醛、γ-松油烯是8种酸鱼样品的共性关键风味物质,其中3-甲基-1-丁醇对酸鱼风味的贡献最大。湖南产地的酸鱼里特有的关键性风味物质有2种:戊醛、庚烷;贵州产地的酸鱼里特有的关键风味物质有6种:反式2-己烯-1-醇、反式β-辛烯、α-松油醇、茴香酮、茴香脑、苯甲醛。这些风味物质的差别可能是由于所添加的香辛料及工艺导致,如贵州产地制作时常常添加的辣椒,而湖南产地一般仅采用小米发酵酸鱼,并没有添加过多的香辛料来增加风味,口味较为清淡。

2.5 不同酸鱼产品微生物多样性分析

图3是8种酸鱼的微生物在门水平及属水平的的物种丰度结果,由门水平图得到酸鱼中的细菌群落归属8个门,分别为厚壁菌门(Firmicutes)、变形杆菌门(Bacteroidetes)、拟杆菌门(Proteobacteria),梭杆菌门(Fusobacteria)、螺旋体菌门(Saccharibacteria)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、酸杆菌门(Acidobacteria)。8种样品在门水平具有相似的种群结构,酸鱼样品中厚壁菌门占主导地位(>85%),其次是变形杆菌门,相对丰度为0.7%～8.5%。酸鱼中的细菌群落归属9个属,乳杆菌属(Lactobacillus)和四链球菌属(Tetragenococcus)在酸鱼样品中为优势菌属,二者相对丰度之和为85%左右。此外,还有一些丰度相对较低的细菌,如魏斯式属(Weissella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、弧菌属(Vibrio),相对丰度分别为0.1%～2.6%、0.05%～5.40%、0.003%～4.000%。乳杆菌是兼性厌氧菌,随着发酵时间的延长,氧气较少,仍能快速生长繁殖,在许多发酵食品中易形成优势菌属,四链球菌属是嗜盐微生物属,在一些高盐发酵食品中常被检测到。据报道,韩国鱼酱中,主要的微生物有乳杆菌以及四链球菌属等[30]。Duan等[31]在虾酱中也发现四链球菌属,其丰度占细菌总数的95.1%。1、2、5号产品中四链球菌占44.9%～57.1%,1、2、5样品在门水平具有相似的种群结构。7、8号四链球菌为主导菌(>86%)。3、4、6号乳杆菌属为优势菌属(>80%)。因此在经过长时间的发酵后,最终酸鱼中形成了以乳杆菌和四链球菌为优势菌群的稳定群落结构。

图3 不同酸鱼产品细菌群落结构Fig.3 Bacterial community structure ofdifferent Suanyu products注:A:门水平;B:属水平。

2.6 不同酸鱼产品的微生物群落与环境因子相关性分析

采用冗余分析较好地描述了不同酸鱼细菌属与环境因子之间的相关性,结果表明主成分分别为RDA1:99.1%,RDA2:0.4%(图4),表明主轴1、2解释了酸鱼群落结构中99.5%的变异,很好地反映出细菌属与环境因子之间的关系。3、4、6号样品中pH,天冬氨酸以及谷氨酸与乳酸杆菌呈正相关关系,与魏斯式菌及葡萄球菌属成负相关关系。有研究在接种了混合菌种(Staphylococcusxylosus和Lactobacillusplantarum)的香肠中,游离氨基酸的含量随着发酵时间逐渐增加[32]。结果表明乳酸杆菌的比例增加有助于酸鱼中鲜味谷氨酸和天冬氨酸的释放,从而形成较好的滋味,葡萄球菌和魏斯式菌可能对谷氨酸和天冬氨酸的生成产生不利影响。醛类物质阈值较低,赋予产品香气能力较强,1、2、5号样品中葡萄球菌和魏斯式菌与庚醛、苯甲醛呈正相关关系,据类似研究报道[33]葡萄球菌可以通过代谢生成苯甲醛等物质。说明葡萄球菌、魏斯式菌有利于促进酸鱼中醛类物质的释放,庚醛赋予酸鱼清甜味。酸鱼风味物质香气活性分析可得3-甲基-1-丁醇、γ-松油烯两种物质对酸鱼风味贡献最大,7、8号样品中3-甲基-1-丁醇、γ-松油烯与四链球菌属风味活性物质的生成具有正相关关系,与乳酸菌呈负相关。在韩国鱼酱中也发现四联球菌属与风味有很大的联系。王蔚新[25]研究表明植物乳杆菌可通过异型乳酸发酵降解亮氨酸等生成3-甲基-1-丁醇等风味物质。说明增加四联球菌丰度有利于酸鱼中共有关键性风味物质的释放,赋予了酸鱼中独特的芳香气味和松油香味。乳酸杆菌会减少酸鱼中3-甲基-1-丁醇和γ-松油烯的生成。

图4 酸鱼中细菌群落与环境因子之间的冗余分析图Fig.4 RDA analysis between bacterial communityand environmental factors in Suanyu

3 结论

8种酸鱼产品的pH范围为4.30～6.20,乳酸含量范围1.35%～3.74%。8种市售酸鱼中生物胺对人体健康不产生危害。酪胺,组胺含量在安全范围内,且含量较低。酸鱼中必需氨基酸有6种:赖氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸。2号对滋味具有贡献的氨基酸种类最多,4、6号样品中鲜味氨基酸对滋味的贡献程度较大。醇类、醛类烃类是酸鱼中主要风味贡献物质。3-甲基-1-丁醇、庚醛、γ-松油烯是8种样品中共性关键性风味物质,分别呈芳香,清甜味,松油气味。8种样品在门水平具有相似的种群结构,酸鱼主要的优势细菌门均为厚壁菌门,主要的优势细菌属均为乳酸杆菌、四链球菌。冗余分析表明乳酸杆菌的增加有助于酸鱼中鲜味谷氨酸和天冬氨酸的释放。葡萄球菌、魏斯式菌有利于促进酸鱼中醛类物质的释放,庚醛赋予酸鱼清甜味。增加酸鱼中四联球菌丰度有利于共性关键性风味物质的释放,赋予了酸鱼中独特的芳香气味和松油香味。乳酸杆菌会减少酸鱼中3-甲基-1-丁醇和γ-松油烯的生成。综合分析市售酸鱼品质比较优良,不同酸鱼产品群落结构呈现差异性,从而影响其挥发性风味物质的生成。发酵过程中应依据产品及风味要求选择相应的发酵条件,以提高产品质量。