黄伟华 颜梅新

摘要 [目的]对广西贺州市荸荠种植区感染秆枯病的荸荠样本进行病原分离鉴定及分析病原菌的侵染过程，为荸荠秆枯病的有效防治提供参考。[方法]以常规组织分离法对发病明显的荸荠茎秆组织进行分离，采用传统的形态学对病原菌进行鉴定。通过制备分生孢子悬浮液接种于载玻片上培养，测定分生孢子萌发情况。利用病菌孢子悬浮液对荸荠茎秆进行离体接种，检测病菌的侵染过程。[结果]分离获得1株病原分离物（Ceh），经形态学鉴定该病原为荸荠柱盘孢菌（Cylindrosporium eleocharidis Lentz）。病菌分生孢子接种于载玻片后4 h开始萌发，8 h后大量萌发，12 h后形成大量附着孢，菌丝24 h后形成。病菌接种荸荠茎秆4 h后，分生孢子开始萌发并产生芽管;8 ～12 h芽管伸长，形成附着孢侵入荸荠茎秆表皮组织;24 h至7 d菌丝形成;接种8 d后，病菌在茎秆表面形成分生孢子盘。[结论]引起广西贺州市荸荠种植区荸荠秆枯病病原为荸荠柱盘孢菌（Cylindrosporium eleocharidis Lentz）。荸荠秆枯病菌分生孢子萌发和侵染过程可用于病原菌和寄主互作机理研究。

关键词 荸荠;秆枯病;Cylindrosporium eleocharidis;孢子萌发;侵染过程

中图分类号 S436.45 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2020）03-0143-03

Abstract [Objective] Pathogen causing stem blight of Chinese water chestnut in Hezhou production zone in Guangxi was identified and infection process of casual organism was analyzed to provide scientific references for protection of Chinese water chestnut planting. [Method] Isolation of pathogen was carried out from the diseased tissues of stem of Chinese water chestnut， and identification of isolate was performed by morphological characteristics. Conidia suspension was prepared to inoculate on slides to test conidia germination and to inoculate on stem of Chinese water chestnut in vitro to analyze infection process of pathogen， respectively. [Result] One isolate strain named Ceh was obtained and identified as Cylindrosporium eleocharidis Lentz with its morphological characteristics. The conidia started to germinate after 4 h incubation and reached the peak of germination at 8 h incubation， whereas a large number of appressoria were formed after 12 h incubation. Hyphae development was observed after 24 h incubation. The conidia began to germinate after 4 h inoculation and produced germ tubes on stem. The germinal tubes could invade any tissues on the epidermis of the stem and form appressoria after 8 h to 12 h inoculation. Hyphae was formed to infected the host cells within 7 days and acervuli were developed on the stem surface after 8 days inoculation.[Conclusion] Stem blight of Chinese water chestnut was regard as causing by Cylindrosporium eleocharidis in Hezhou Chinese water chestnut growing area in Guangxi. Analysis of conidia germination and infection process of casual organism could be used for the study interaction between pathogen and host.

Key words Chinese water chestnut;Stem blight;Cylindrosporium eleocharidis;Conidia germination;Infection process

荸薺（Eleocharis dulcis）为莎草科（Cyperaceae）荸荠属（Eleocharis）多年生草本植物，原产于我国和印度，在我国有2 000多年的栽培历史。目前，荸荠主要栽培于我国长江流域及其以南各省，广西则以桂林、贺州等地区广泛种植;美国、菲律宾、越南、澳大利亚、日本等国亦有栽培[1-2]。荸荠球茎营养丰富，富含碳水化合物，可作为水果、蔬菜食用，亦具有药用价值 [3-4]。然而荸荠在栽培过程中常受病害侵扰，其中以秆枯病（俗称“荸荠瘟”）发生最为严重。该病病原为荸荠柱盘孢菌（Cylindrosporium eleocharidis Lentz），属半知菌类黑盘孢目柱盘孢属。该病主要危害叶鞘、叶状茎、花器等部位，严重影响荸荠的产量和品质[5-7]。近年来笔者在广西贺州荸荠产区调查发现，每年9—10 月是该地区荸荠秆枯病流行的季节，荸荠秆枯病已成为贺州荸荠产业发展的主要障碍之一。当前关于荸荠秆枯病的研究较少，荸荠秆枯病于1962年在美国首次报道[8]。我国则于1985年在江苏省报道荸荠秆枯病的发生[9]。随后，广西报道了荸荠秆枯病的发生与危害[10] 。通过对该病流行情况的分析，发现荸荠秆枯病的发生和流行与气温、湿度、降雨量、露水等环境因素密切相关，赖传雅等[5]建立了预测模型（D=5.554 7-0.031X1+0049X2+0.523 3X3-0.348 7X4）。近年来，潘丽等[7]报道湖北省荸荠遭到秆枯病的危害，并对该病病原及生物学特性进行了研究。

贺州作为荸荠的主产区之一，未见关于荸荠秆枯病病原鉴定的报道。因此，为明确广西贺州荸荠秆枯病病原分类地位和病原菌的侵染过程，笔者对贺州市荸荠种植区感染秆枯病的荸荠进行病原分离鉴定及分析病原菌的侵染过程，以期为有效防治荸荠秆枯病和研究病原菌与寄主互作提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

荸荠秆枯病样本于2016 年8月采集于广西贺州市荸荠栽培区。

1.2 方法

1.2.1 荸荠秆枯病病原菌分离。

病原菌分离采用常规的组织分离法[11]。从病健交界处切取5 mm×5 mm的小块，经表面消毒（ 75%乙醇10 s，0.1%升汞1 min，无菌水冲洗2～3 次）后移入马铃薯、葡萄糖、琼脂（PDA）培养基上，28 ℃培养5 d，待菌丝在平板上长出后，挑取菌落边缘单菌丝的尖端移入不加抗生素的PDA 培养基上进行纯化，将纯化后的菌株移至 PDA 斜面上，放入4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 病原菌的致病性测定。

致病力测定参照赵玳琳等[12]的方法，稍作修改。选取健康、大小一致的荸荠茎秆，经75%乙醇表面消毒后剪取茎秆约20 cm长，放置于铺有湿润吸水纸的塘瓷盘中，荸荠茎秆两端采用湿润的吸水纸覆盖保湿。用直径6 mm的打孔器在PDA平板上培养7 d的病菌菌落边缘打孔，提取菌丝块接种至针刺过的茎秆上，无菌培养基块接种设为对照，盖上盖子，置于28 ℃恒温培养箱中培养。每个处理各5根茎秆，每根茎秆设2个接种点。7 d 后观察发病情况。对接种发病的荸荠茎秆组织进行病原菌再分离，观察分离物是否与接种菌株一致。

1.2.3 病原菌形态学鉴定。

将分离纯化获得的菌株在PDA培养基上28 ℃培养5 d后，切取菌落边缘的菌丝块移至PDA培养基中央，放置生化培养箱中28 ℃培养15 d，观察菌落形态，通过光学显微镜（carl zeiss）观察菌株的菌丝、分生孢子、分生孢子盘等形态特征。病原菌的鉴定根据病害症状、病菌菌落形态、分生孢子、分生孢子梗及分生孢子盘形态，参照魏景超[13]对柱盘孢属和Lentz[8]、李清铣等[9]、赖传雅等[10]、潘丽等[7]对荸荠柱盘孢菌的形态特征描述进行病原鉴定。

1.2.4 病原菌分生孢子萌发。

病菌在PDA平板上培养15 d后，吸取5 mL无菌水滴在PDA平板上的菌落表面，用无菌接种环刮取菌丝，采用2层擦镜纸过滤菌丝获得分生孢子悬浮液，用血球计数板将分生孢子悬浮液浓度调至107 个/mL，然后吸取分生孢子悬浮液滴至载玻片上，盖上盖玻片，将其放入铺有吸水纸的9 cm培养皿中，盖上皿盖子，置于28 ℃恒温培养箱中保湿培养，接种后分别于4、8、12和24 h在光学显微镜下观察分生孢子萌发情况。

1.2.5 病原菌侵染过程。

病菌孢子悬浮液配制同“1.2.4”。选取健康的荸荠茎秆，经75%乙醇表面消毒后剪取茎秆约20 cm长，放置于铺有湿润吸水纸的塘瓷盘中，荸荠茎秆两端采用湿润的吸水纸覆盖保湿。将上述配好的浓度为107 个/mL 孢子悬浮液接种至荸荠茎秆表面上，无菌水接种设为对照，盖上皿盖子，置于28 ℃恒温培养箱中保湿培养，接种后分别于4 h、8 h、12 h、24 h、2～8 d剪取接种部位，制成玻片在光学显微镜下观察病菌侵染情况。

2 结果与分析

2.1 病害症状

荸荠秆枯病主要危害茎秆，初为暗绿色不规则水渍状斑，后扩展形成棱形或椭圆形至不规则暗绿色斑，病茎变软凹陷，其上产生小黑点，之后愈合形成较大的病斑，重者整株枯死、倒伏（图1A）。

2.2 病原菌的形态特征

从表现明显症状的荸薺茎秆组织分离纯化获得1菌株，命名为Ceh。在PDA培养基上培养7 d后，菌落中间为墨绿色，气生菌丝绒毛状，菌落边缘整齐。15 d后开始产孢，分生孢子无色，线形，无分隔，中间稍宽，基部稍钝圆，直，向一侧或不规则弯曲，分生孢子大小为36.0～107.32 μm×3.34～8.86 μm（图1D）;分生孢子梗无色或浅褐色，丛生，瓶形、梨形或窄卵形，无分隔，大小为6.78～28.25 μm×3.25～9.25 μm。经致病性试验，所引起的症状与原症状相似（图1B），从接种发病的组织处再分离获得的分离物与田间发病组织分离的病原菌形态一致。根据病菌的培养性状和形态特征，参照魏景超[13]的分类方法和Lentz[8]、李清铣等[9]、赖传雅等[10]、潘丽等[7]对荸荠柱盘孢菌的特征描述，将菌株Ceh鉴定为荸荠柱盘孢菌（Cylindrosporium eleocharidis Lentz）。

2.3 荸荠秆枯病菌孢子萌发

荸荠秆枯病菌分生孢子悬浮液接种至盖玻片上4 h后开始萌发，分生孢子两端形成1个或2个芽管，无附着孢产生（图2A）;接种8 h后分生孢子大量萌发，芽管伸长，产生圆形或椭圆形附着孢（图2B）;接种12 h产生大量附着孢，颜色为深褐色或黑色（图2C）;24 h后菌丝形成（图2D）。

2.4 荸荠秆枯病菌侵染寄主的过程

荸荠秆枯病菌分生孢子在接种至荸荠茎秆表面4 h后分生孢子开始萌发，芽管形成（图3A）;接种8～12 h芽管伸长，侵入荸荠茎秆表皮组织，然后在茎秆表面形成深褐色附着孢（图3B，箭头所示）;24 h（l d）～7 d后，病菌菌丝形成，侵入寄主组织细胞并在细胞间蔓延（图3C、D，箭头所示）;接种8 d后分生孢子盘和大分生孢子出现（图3E）;接种20 d后，菌丝和分生孢子消融，分生孢子盘与寄主组织形成病残体（图3F）。

3 讨论

荸荠秆枯病是我国荸荠最重要的病害之一，严重影响荸荠的产量和品质[7-10]。近年来，有报道称Phoma bellidis也可导致荸荠茎秆枯萎，其所致症状与C.eleocharidis引起的症状稍有不同，该病在湖北零星发生，是一种新病害[14]。参照魏景超[13]的分类方法和Lentz[8]、李清铣等[9]、赖传雅等[10]、潘丽等[7]对荸荠柱盘孢菌的特征描述，确定了贺州地区荸荠秆枯病病原菌为荸荠柱盘孢菌（Cylindrosporium eleocharidis Lentz）。该研究分离获得菌株Ceh的分生孢子梗和分生孢子的大小与赖传雅等[10]分离的菌株接近，可能是因为这两者均来自广西荸荠种植区。另外，笔者试图通过其DNA序列分析（数据未显示）对荸荠秆枯病菌进行鉴定。然而，ITS序列分析表明，该菌序列与GenBank中炭疽菌属分离物核苷酸序列相似性为94%～96%，但两者在形态特征上存在明显差异，可能是因为在世界范围内荸荠秆枯病菌的研究较少。

C.eleocharidis接种载玻片4 h后，分生孢子开始萌发，8 h后达到萌发高峰，12 h后形成大量的附着孢。在真菌胶孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）[15]中也获得类似的结果。C.eleocharidis分生孢子接种荸荠茎秆4 h后开始萌发，在茎秆表面上产生芽管。接种8～12 h后，芽管可从荸荠茎秆表皮任何组织侵入，形成附着孢。7 d内形成菌丝，侵染宿主细胞，接种8 d后在茎面上形成分生孢子盘。这些研究结果与对稻瘟病（magnaporthe oryzae）[16]和胶孢炭疽病菌（Colletrichum gloeosporioides）[17]孢子萌发和侵染过程相似。

近几年来，随着荸养种植面积的扩大和连作，荸荠种茎的频繁调运，荸荠秆枯病日趋严重。由于该病的致病机理尚不清楚，对现有技术仍远不能达到有效地遏制该病蔓延和传播的要求。因此，从不同角度、以不同方法去研究和发展新的控制该病的技术十分必要，未来的研究工作将建立荸荠秆枯病菌遗传转化体系，研究该病原菌的致病机理，为该病害新的防治技术提供靶标基因。

4 结论

引起广西贺州市荸荠种植区荸荠秆枯病病原为荸荠柱盘孢菌（Cylindrosporium eleocharidis Lentz）。荸荠秆枯病菌分生孢子萌发和侵染过程的研究可用于病原菌和寄主互作机理研究，为荸荠秆枯病菌的防治提供理论依据。

参考文献

[1] 颜梅新，袁高庆，陈世伟，等.荸荠贮藏期真菌性病害种类调查鉴定初报[J].广西农业生物科学，2003，22（2）：96-99.

[2] 李峰，柯卫东，刘义满.荸荠研究进展[J].长江蔬菜，2006（8）：39-43.

[3] PARKER M L，WALDRON K W.Texture of Chinese water chestnut：Involvement of cell wall phenolics[J].Journal of the science of food & agriculture，1995，68（3）：337-346.

[4] GRASSBY T，JAY A J，MERALI Z，et al.Compositional analysis of Chinese water chestnut（Eleocharis dulcis）cellwall material from parenchyma，epidermis，and subepidermal tissues[J].Journal of agricultural and food chemistry，2013，61（40）：9680-9688.

[5] 赖传雅，梁钧.环境因素对荸荠秆枯病流行动态的影响[J].西南农业学报，2000，13（3）：54-57.

[6] 颜梅新，袁高庆，赖传雅，等.荸荠秆枯病的发生及其防治研究[J].广西农业科学，2006，37（3）：273-276.

[7] 潘丽，朱志贤，吕茹婧，等.荸荠秆枯病菌生物学特性研究[J].长江蔬菜，2011（16）：75-79.

[8] LENTZ P L.New records of fungi on Chinese waterchestnut[J].American midland naturalist，1962，67（1）：184-193.

[9] 李清铣，王连荣.江苏荸荠秆枯病的发生、危害及病原菌鉴定[J].江苏农学院学报，1985，6（4）：37-39.

[10] 赖传雅，梁钧，白志良，等.荸荠秆枯病病原菌研究[J].广西农业大学学报，1996，15（2）：93-97.

[11] 方中达.植病研究方法[M].北京：中国农业出版社，1998.

[12] 赵玳琳，陈威，黄俊斌，等.荸荠茎点霉秆枯病菌侵染过程的超微观察[J].植物病理学报，2016，46（6）：841-845.

[13] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.

[14] LV R J，ZHENG L，ZHU Z X，et al.First report of stem blight of Eleocharis dulcis caused by Phoma bellidis in China[J].Plant disease，2011，95（9）：1190.

[15] 黃麟，杨济云，方玉兰，等.杉木炭疽菌遗传转化及附着胞发育过程的细胞核行为观察[J].南京林业大学学报（自然科学版），2017，41（6）：68-72.

[16] 许有嫔，廖海澄，陈金华，等.利用绿色荧光蛋白GFP研究稻瘟病菌与水稻的互作[J].植物保护，2017，43（6）：53-61.

[17] 张晓林，张俊娥，贺璞慧中，等.胶孢炭疽菌侵染杨树叶片的组织病理学研究[J].北京林业大学学报，2018，40（3）：101-109.