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(1.西北师范大学,生命科学学院,甘肃兰州 730000;2.甘肃省特色植物有效成分制品工程技术研究中心,甘肃兰州 730070)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)是芸香科花椒属植物。据目前研究我国现有45种不同的花椒,其中有13种属于变种花椒[1]。其在我国分布广泛,主要分布在四川、陕西、山西、甘肃等地区[2]。花椒中含有生物碱、脂肪酸、香豆素、木脂素、酰胺、芳香油等化学成分,在这些化学成分中芳香油的含量最高[3-4]。中医认为,花椒性温,味辛,除了可以作为调味品外,还具有众多药用功效,包括镇痛、麻醉、抗菌、杀虫、抗氧化等,在医药方面具有广泛的应用前景[5-6]。大红袍为芸香科落叶灌木或小乔蜀椒的果实,果皮名椒红,其被誉为“八大调味品”之一。研究表明大红袍花椒中不仅含有大量的芳香油成分,而且还含有丰富的脂肪油成分,主要包括油酸、亚油酸、亚麻酸、棕榈酸、棕榈烯酸、硬脂酸、花生酸等成分,经过提炼可以达到食用油的标准,是一种药食同源物质[7]。

甘肃省陇南市武都区栽植花椒历史悠久,自古就是优质花椒的故乡,素有“千年椒乡”之美誉。花椒适生范围广,全区36个乡镇中有34个乡镇适宜发展花椒产业。其盛产的花椒品质优异,民间冠以“大红袍”之称。“大红袍”花椒粒大饱满、麻味醇厚,其提取的芳香油含量高,且药效成分较多[8]。

对于花椒芳香油化学成分分析和抑菌效果研究,国内外学者主要研究的是不同地区大红袍花椒芳香油的化学成分和抑菌效果,但是对于甘肃陇南地区的大红袍花椒挥发油的化学成分和抑菌方面的研究未见报道。唐裕芳等[9]采用水蒸气蒸馏法提取四川红皮花椒中的芳香油,运用GC-MS对其成分进行分析鉴定,并对芳香油进行抑菌活性研究,研究发现花椒芳香油中含有的烯醇及其酯类衍生物、萜烯类化合物等物质,具有较强的抑菌活性。干信等[10]采用水蒸气蒸馏法提取陕西大红袍花椒中的芳香油,并对其芳香油的抑菌性进行研究,研究发现花椒芳香油不仅能抑制革兰氏阴性菌,也能抑制革兰氏阳性菌,同时对霉菌、真菌也有抑制作用,尤其对青霉和黑曲霉的抑菌效果最好。本文以甘肃陇南的大红袍花椒为研究对象,采用水蒸气蒸馏法提取其花椒芳香油,并对芳香油的化学成分和抑菌性进行分析研究,为陇南花椒的进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大红袍花椒 采自甘肃陇南地区;金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,CMCC 26003)、大肠杆菌(Escherichiacoli,ATCC 25922)、破伤风杆菌(Nicolaieri’sbacillus,ATCC 19406)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescence,ATCC 13525) 供试致病菌由西北师范大学微生物实验室提供;乙醚(AR) 天津市津冬天正精细化学试剂厂。

7890A型气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司;DRT-TW型调热电热套、JY2002型电子天平 力辰科技公司;BSC-1300ⅡA2生物安全柜 苏州安泰公司;TS-100C恒温摇床 上海天呈公司;YXQ-SG46-280S高压灭菌锅 北京中西公司;营养培养基(LB) 南通凯恒生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芳香油提取 参照文献[11]中提取芳香油的方法,进行修改。称取样品100 g粉碎并过30目筛,装入2000 mL的圆底烧瓶中,加蒸馏水800 mL及数粒玻璃珠,浸泡过夜,连接挥发油测定器及回流冷凝管,并在挥发油测定器中加入蒸馏水至溢流入圆底烧瓶中,将圆底烧瓶于电热套上加热,调节加热温度为120 ℃,蒸馏10 h后,停止加热并冷却。从挥发油测定器中放出提取物转移至分液漏斗,加入少量乙醚进行萃取,过滤,常温下挥干乙醚,得到黄色有特殊香味的芳香油,称重计算得油率为6.223%,4 ℃冰箱保存待测。

1.2.2 芳香油的测定条件

1.2.2.1 气相色谱分析条件 气相色谱条件:石英毛细管柱HP-5MS,30 m×0.25 mm,膜厚0.25 μm;升温程序:初始温度60 ℃以10 ℃/min升至210 ℃,保持2 min,再以4 ℃/min升至280 ℃,保持2 min;载气:He;柱流量:1 mL/min;进样口温度:280 ℃[12]。

1.2.2.2 质谱分析条件 质谱条件:EI源;电离电压:70 eV;离子源温度:250 ℃;扫描范围:50～650 amu;进样量:2 μL;分流比:20∶1。

1.2.3 不同大红袍花椒芳香油成分的对比 对甘肃陇南、陕西韩城、四川茂县大红袍花椒芳香油成分进行对比。

1.2.4 芳香油的体外抑菌实验

1.2.4.1 供试菌悬液和芳香油供试品溶液的制备 将实验所用菌种金黄色葡萄球菌、破伤风杆菌、大肠杆菌分别接种于营养培养基(LB)上，在适宜温度下37 ℃活化12 h,荧光假单胞杆菌在27 ℃活化12 h,最后再用无菌水制备成5 mL/L(1.5×108CFU/mL)的菌悬液,置于4 ℃冰箱中备用。将制得的大红袍花椒芳香油按照倍比稀释法,用营养培养基(LB)作为溶剂,将其稀释成80、40、20、10、5、2.5、1.25 mL/L 7个浓度梯度的溶液。

1.2.4.2 芳香油抑菌活性的测定 采用滤纸片扩散法[10]。用打器将滤纸制作成直径为6.0 mm的小圆纸片,将小圆片滤纸贴于已涂布5 mL/L菌悬液的LB培养基上,取大红袍花椒芳香油5 μL滴到每张小圆滤纸片上,用无菌水作为对照,并将其放入37 ℃的恒温培养箱中培养24 h。观察细菌的生长情况并记录相关数据。测量抑菌圈的直径,重复3次。

1.2.4.3 芳香油的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定 参照文献[10]的操作步骤,并稍作修改。将稀释至一系列浓度梯度的芳香油中加入菌悬液,并将其放入37 ℃的恒温培养箱中培养12 h,观察菌体的生长情况,此时的浓度为芳香油的最小抑菌浓度。继续培养24 h,观察菌体的生长情况,此时的浓度为芳香油的最小杀菌浓度。重复实验3次。

1.3 数据处理

运用Origin、SPSS 20软件对其所得数据进行分析。

2 结果与讨论

2.1 芳香油成分鉴定

运用气相色谱-质谱联用(GC-MS)对陇南大红袍花椒芳香油成分进行分析鉴定,并用色谱峰面积归一化法测定了各成分的相对百分含量,结果见图1、表1。

图1 陇南大红袍芳香油总离子图Fig.1 Total ionogram of aromatic oil in Longnan Dahongpao

表1 陇南大红袍花椒芳香油化学成分及相对含量Table 1 Chemical constituents and relative contents of aromatic oil of Zanthoxylum bungeanum in Longnan Dahongpao

续表

2.2 芳香油成分分析

经过气相色谱-质谱联用进行分析,陇南大红袍芳香油共分离出67个组分,鉴定出50种化学成分,占总量的92.49%,其中萜类化合物的含量最高,芳香族化合物含量次之。在已鉴定的化合物中,相对百分含量在1%以上的有12种,含量占被检出物质总量的81.83%,其主要的化学成分包括D-柠檬烯(32.08%)、右旋香芹酮(20.02%)、石竹烯(12.26%)、4-萜烯醇(2.92%)、肉豆蔻烯(2.76%)和芳樟醇(2.34%)等,其中含量最高的为D-柠檬烯,高达32.08%。上面八种主要化学成分占总量的76.96%。据最近研究表明,柠檬烯不仅是一种重要的香精香料添加剂,而且还具有抑菌性、防腐保鲜、抗氧化、抗炎症等多种功效[13]。右旋香芹酮是植物芳香油中重要的抑菌活性成分[14]。其中柠檬烯、石竹烯等均是天然精油中重要的萜烯组分,为可以直接使用的天然食品香料,石竹烯具有抗炎杀菌、局麻、驱蚊虫、抗抑郁等作用[15]。芳樟醇在花椒芳香油中的含量较高,其有抗菌杀虫的功效[16]。其中还检出了少数烷烃,其可能是芳香油本身含有的成分,就其原因还有待进一步研究。

2.3 与陕西韩城、四川茂县大红袍花椒芳香油成分的对比

表2 不同地区大红袍花椒芳香油的主要化学成分的对比Table 2 Comparison of main chemical constituents of Zanthoxylum bungeanum aromatic oil from different regions

注:-表示未检测出。由表2可知,甘肃陇南、陕西韩城、四川茂县的大红袍花椒芳香油中均含有柠檬烯、芳樟醇、β-月桂烯、γ-松油烯、罗勒烯等化学成分,其中柠檬烯的含量在不同地区大红袍花椒芳香油的含量均为最高,然而甘肃陇南地区的大红袍花椒芳香油中柠檬烯的含量最高,达到32.08%。在甘肃陇南大红袍花椒芳香油中含量较高的右旋香芹酮和石竹烯,在陕西韩城和四川茂县的大红袍花椒中均未检测到。芳樟醇、罗勒烯在四川茂县大红袍花椒芳香油中含量均最高。而β-月桂烯、γ-松油烯在陕西韩城大红袍花椒芳香油中含量均最高。芳樟醇在花椒中的含量较高,其有抗菌杀虫的功效[16]。月桂烯本身可能具有一定的抑菌效果。罗勒烯、月桂烯等成分是花椒香气的主要来源物质。

2.4 芳香油抑菌效果

2.4.1 芳香油抑菌活性测定 通过对芳香油进行抑菌活性测定,得到图2、表3。

由表3可知,通过对陇南大红袍花椒芳香油进行抑菌实验,4种菌出现了大小不同的抑菌圈。说明了大红袍花椒芳香油对4种细菌有不同程度的抑菌效果。其抑菌效果很可能与大红袍花椒挥发油中化学成分含量较高的柠檬烯、右旋在香芹酮、石竹烯和芳樟醇等有关,其具体的作用机制,还有待进一步研究。

表3 陇南大红袍芳香油的抑菌圈直径(mm)Table 3 Bacteriostasis circle diameter of aromatic oil from Longnan Dahongpao(mm)

注：同列不同小写字母表示差异显著，P<0.05。

表4 不同浓度的大红袍花椒芳香油的抑菌作用Table 4 Bacteriostasis of Dahongpao Zanthoxylum bungeanum fragrant oil with different concentrations

注:-表示不长菌,+表示长菌。

表5 不同浓度的大红袍芳香油的杀菌作用Table 5 Sterilization of Dahongpao aromatic oil with different concentrations

注:-表示不长菌,+表示长菌。

图2 陇南大红袍芳香油对4种菌的抑菌效果Fig.2 Antimicrobial effect of aromatic oil from Longnan Dahongpao on four kinds of bacteria注:a:大肠杆菌;b:金黄色葡萄球菌;c:破伤风杆菌;d:荧光假单胞杆菌。

2.4.2 芳香油的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定 通过对芳香油进行等比稀释,测定其最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC),结果如表4、表5。

由表4、表5可知,大红袍花椒芳香油对于这4种菌的抑菌效果会随着其浓度的变化而变化。对于大肠杆菌,大红袍花椒芳香油的MIC和MBC分别为2.5和10 mL/L;对于金黄色葡萄杆菌,大红袍花椒芳香油的MIC和MBC分别为2.5和5 mL/L;对于破伤风杆菌,大红袍花椒芳香油的MIC和MBC分别为5.0和10 mL/L;对于荧光假单胞杆菌,大红袍花椒芳香油的MIC和MBC分别为2.5和5 mL/L。其对于金黄色葡萄球菌和荧光假单胞杆菌的抑菌效果较好。

3 结论与讨论

经过气相色谱-质谱联用进行分析,陇南大红袍芳香油共分离出67个组分,鉴定出50种化学成分,占总量的92.49%,其中萜类化合物的含量最高,芳香族化合物含量次之。其主要的化学成分包括D-柠檬烯(32.08%)、右旋香芹酮(20.02%)、石竹烯(12.26%)、4-萜烯醇(2.92%)、肉豆蔻烯(2.76%)等,其中含量最高的为D-柠檬烯,高达32.08%。在甘肃陇南大红袍花椒芳香油中含量较高的右旋香芹酮和石竹烯在陕西韩城和四川茂县的大红袍花椒中均未检测到,这些不同之处可能与花椒的生长地区有关。目前研究表明,花椒芳香油主要化学成分的种类和含量会因其生长地区和品种的不同而不同[17-21]。在花椒芳香油中含量最高的柠檬烯不仅是一种重要的香精香料添加剂,而且具有抑菌性、防腐保鲜、抗氧化、抗炎症等多种功效[13]。

通过对陇南大红袍花椒芳香油进行抑菌性研究,发现其对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、破伤风杆菌、荧光单胞杆菌这四种细菌均具有抑菌性,说明陇南大红袍花椒芳香油不仅对革兰氏阴性菌(大肠杆菌和荧光假单胞杆菌)有抑菌效果,而且对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和破伤风杆菌)也有抑菌效果。芳香油的抑菌效果随着芳香油浓度的变化而变化,因此芳香油的MIC和MBC就至关重要,对于提取开发和生产天然抑菌剂并将其用于医疗行业提供了一定的理论基础。但是对于芳香油中各种化学成分的协同作用机制和其抑菌活性在生产应用中的实际效果都有待进一步深入研究。