张欣悦，罗翠琴，陈小洁，王其，王璐，丁婷

安徽农业大学植物保护学院，安徽合肥长江西路130号 230036

烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）所引起的一种细菌性土传病。目前，烟草青枯病的防治以化学药剂为主，但化学药剂的大量持续性施用易造成病原菌抗药、环境污染等难以克服的问题，不利于生态环境的保护和农业的可持续发展。随着农作物病害防治技术的进步，烟草青枯病的生物防治日益引起科研工作者的重视。

健康植株根际是微生物定殖和发挥活性的重要区域，其根际土壤中含有的大量有益微生物对植物病害的生物防治具有重要意义。如在植物根际广泛存在的假单孢杆菌可产生嗜铁素，通过在根际掠夺其他有害或病原菌生长所必需的Fe 元素，而使病原菌活性降低，生长缓慢[1]；利用能够促进植物生长的根际细菌（PGPR）可以抑制植物土传病害[2]。为了筛选对烟草青枯病有拮抗作用的微生物并研究其机理，本试验对表现优异的菌株开展芽孢杆菌生防标记基因的检测，并研究烟草根系分泌物及其所含的各种有机酸对拮抗菌根部定殖的影响，旨在明确拮抗菌的生防机制，为进一步开发利用优良的生防菌株提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

烟草青枯病菌由安徽农业大学植物保护学院植物病理教研室提供，属1 号生理小种。

拮抗菌株GZYCT-4 和GZYCT-9 自贵州地区健康烟株根际土壤中分离纯化得到，均为贝莱斯芽孢杆菌，其NCBI 登录号分别为MH341165.1 和MH341164.1。

解淀粉芽孢杆菌模式菌株FZB42 由安徽农业大学安徽省作物生物学重点实验室提供。

1.1.2 供试烟草品种和培养基

供试烟草品种分别为烟草K326 及红花大金元，由安徽农业大学植物病理教研室江彤教授课题组提供。

生防菌的培养、分离以及抑菌活性的测定均使用牛肉膏蛋白胨培养基（NA）[3]；脂肽物质培养使用Landy 培养基[4]。

烟草青枯病菌的培养使用TTC 培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，水1000 mL，pH 7.0～7.2，加入1 %TTC 混合均匀。

1.2 两株烟草拮抗细菌对烟草青枯病菌的活性测定

将烟草拮抗细菌GZYCT-4 和GZYCT-9 分别接种到50 mL NA 液体培养基中，在转速180 r/min、28℃条件下发酵24 h，得到GZYCT-4 和GZYCT-9 的液体发酵物。

拮抗细菌对烟草青枯病菌的活性测定采用牛津杯法[5]：取1 mL 烟草青枯病菌菌悬液（1×106cfu/mL），与20 mL 融化的冷却至45℃的TCC 培养基充分混合均匀，制成含烟草青枯病菌的培养基；平板边缘各距中心2.5 cm 处放置牛津杯（孔直径为6 mm），吸取0.2 mL GZYCT-4 和GZYCT-9 液体发酵物于牛津杯孔内，以无菌NA 液体培养基为对照。置于30℃恒温培养箱中培养，48 h 后用游标卡尺测定抑菌圈大小。每个处理重复3 次。

1.3 拮抗菌株对烟草青枯病的盆栽防效试验

2018 年7 月在安徽农业大学教学实习基地农萃园进行。选择烟草青枯病感病品种红花大金元和抗病品种K326 进行盆栽试验。试验用土为混配营养土（细黄土:泥炭土＝1:1(V/V)）。采用拌土接种法，烟草青枯病菌的接种量为5×106 cfu /g 土。在烟草移栽前，每盆撒入200 g 菌土（每钵装土4 kg）。

试验设置5 种处理：①病原菌处理组：4 叶期烟苗移栽至含有青枯病菌菌土的盆钵，缓苗2 d 后，进行正常水肥管理；②拮抗菌GZYCT-4（1×108cfu /mL）处理组：4 叶期烟苗根部侵入GZYCT-4 菌悬液中，蘸根30 min 后，移栽至含有青枯病菌菌土的盆钵，缓苗2 d 后，采取灌根接种的方法，每株分别灌15 mL的GZYCT-4 菌悬液，重复接种2 次，间隔期为15 d；③拮抗菌GZYCT-9（1×108 cfu /mL）处理组：4 叶期烟苗的蘸根和灌根处理方式和处理时间同GZYCT-4处理组；④72%农用硫酸链霉素处理组：4 叶期烟苗移栽至含有青枯病菌菌土的盆钵，缓苗2 d 后，每株灌40 mL 浓度1.25 mg/mL 的 72 % 农用硫酸链霉素可湿性粉剂溶液；⑤空白对照处理组：4 叶期烟苗移栽至不含青枯菌的混配营养土中，缓苗2 d 后，每株灌15 mL 的灭菌NA 液体培养基。每个处理20 盆，3 次重复。植株置于28～36℃防虫温室内培养，在烟草旺长期调查不同处理组烟草青枯病的发病情况[6]，统计发病率，计算病情指数和防治效果。

1.4 拮抗菌株抗菌脂肽物质的检测

1.4.1 拮抗菌株脂肽粗提物的制备

将GZYCT-4 和GZYCT-9 菌株接种于NA 培养液中，在30℃、200 r/min 条件下发酵24 h，得到拮抗菌的液体发酵物。分别吸取5 mL 拮抗菌液体发酵物接种于150 mL Landy 液体培养基中，30℃、200 r/min 条件下振荡培养38 h 后，培养液离心去除菌体细胞，上清液加入 HCl（6 mol/L）调pH 至 2.0，4℃静置过夜，收集沉淀，向沉淀中加入适量色谱级甲醇，用无菌棒搅拌溶解，4℃静置8 h，上清液旋转蒸发，冻干，即为脂肽粗提物。脂肽粗提物无菌水溶解，配制成100 µg/mL 的母液，备用[7-8]。

1.4.2 拮抗菌株脂肽类粗提取物的平板拮抗试验

采用牛津杯法，含烟草青枯病菌的培养基制备方法同1.2，距培养皿边缘2 cm 处对称放置牛津杯，牛津杯中分别加入150 µL GZYCT-4 和GZYCT-9 脂肽类物质粗提物，以解淀粉芽孢杆菌菌株FZB42 的脂肽粗提物（100 µg/mL）为阳性对照，无菌水作为阴性对照，置于30℃恒温培养箱中培养，48 h 后用游标卡尺测定抑菌圈大小。每个处理重复3 次。

1.4.3 拮抗菌生防标记基因的鉴定

用于生防标记基因 bmy B、fen D、itu C、srf AA、srf AB、bio A、yng G 和ynd J 的8 对特异引物均在安徽通用生物公司合成，引物序列见表1，扩增条件参考杨瑞先[9]等方法。将扩增产物回收纯化后测序，测序所得序列通过NCBI 数据库进行BLAST 比对。

1.5 烟草根系分泌物及有机酸对拮抗菌根部定殖的影响

1.5.1 不同烟草品种根系分泌物的制备

烟草根系分泌物收集参考吴凯[10]等方法，将烟草种子播种在装有泥炭土的盆钵中，放置在温室中培养（28～30 ℃，光周期为16 h 光照/8 h 黑暗交替）。30 d 后，待烟草长至15～20 cm 左右时，取出整株烟草，在自来水下冲洗干净根系，蒸馏水润洗三次，随后将其转入盛有150 mL 无菌双蒸水的烧杯中，所有根系都浸入水中（28～30 ℃，光周期为16 h 光照/8 h 黑暗交替）。培养48 h 后，收集培养液，冷冻干燥，得到烟草根系分泌物冻干粉。称取适量根系分泌物冻干粉，用无菌水配成浓度10 mg/mL 的母液，置于4℃冰箱备用。

表 1 用于鉴定脂肽合成基因的引物Tab. 1 Primer sequences used for identification of ipopeptide synthesis genes

1.5.2 烟草根系分泌物中有机酸的测定

利用高效液相色谱（HPLC, Agilent1200,USA）鉴定烟草根系分泌物中有机酸的种类及含量。流动相以及检测条件参照Tan[11]等方法，有机酸标准样品包括草酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸和富马酸等共9种有机酸（Sigma 生物公司，分析纯）。在相同色谱条件下，对混合标样和待测根系分泌物进行色谱分析，记录峰面积保留时间，通过与标样保留时间的比对鉴定样品中有机酸的种类。

1.5.3 烟草根系分泌物及有机酸对拮抗菌定殖影响

GZYCT-4 和GZYCT-9 液体发酵产物高速离心，收集菌体，磷酸缓冲液冲洗菌体，并调整至OD600=0.1。参照Rudrappa 等[12]方法，1 mL 注射器针头分别吸取100 µL 的红花大金元（10 mg/mL）和K326（10 mg/mL）烟草根系分泌物溶液、苹果酸（10 µg/mL）、草酸（10 µg/mL）、柠檬酸（10 µg/mL）、琥珀酸（100 µg/mL）样品溶液，且吸取100 µL 无菌水作为阴性处理组；200 µL 枪头吸取100 µL拮抗菌菌液，将含有不同样品的注射器的针头插入装有菌液的枪头细口端，使根系分泌物、有机酸溶液或无菌水和菌液充分接触，30℃无菌条件下水平放置3 h后，将注射器中的烟草根系分泌物、有机酸溶液和无菌水采用系列稀释法，涂布平板计数其中拮抗菌的菌数。每个处理设置3 个重复。

1.6 数据处理

采用DPS 软件中的Duncan 新复极差法对数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 两株烟草拮抗细菌对烟草青枯病菌的活性检测

牛津杯平板培养法测定GZYCT-4 和GZYCT-9 菌株对青枯病菌的抑菌活性如表2 所示，GZYCT-4 和GZYCT-9 对烟草青枯病菌的抑菌圈直径分别为16.64 mm 和18.90 mm，GZYCT-9 对烟草青枯菌的抑菌活性显著优于GZYCT-4。

表2 烟草根际细菌GZYCT-4 和GZYCT-9 对青枯病菌的拮抗作用Tab.2 Antifungal activities of GZYCT-4 and GZYCT-9 against Ralstonia solanacearum

2.2 拮抗菌株GZYCT-4 和GZYCT-9 的盆栽控病试验

旺长期调查五个处理组的烟草植株青枯病的发病情况，结果如表3 所示。经GZYCT-4 菌悬液处理的红花大金元烟株对青枯病的防效达到了51.83%，与农用链霉素处理组防效（52.51%）无明显差异，与GZYCT-9 处理组防效（38.96%）有显著差异；而经GZYCT-9 菌悬液处理的抗病品种K326 烟株，其病情指数明显低于病原菌处理组，其青枯病的防治效果达到58.62%，与农用链霉素处理组防效（61.01%）有一定差异，与GZYCT-4处理组防效（32.14%）有显著差异。由上述结果可知，GZYCT-4 和GZYCT-9 拮抗菌施用到不同的抗感病烟草品种上，均能有效地防控其烟草青枯病的发病程度，其中，GZYCT-9 对K326 烟株防治效果优于GZYCT-4 拮抗菌处理，而GZYCT-4 对红花大金元烟株防治效果则优于GZYCT-9 拮抗菌。

表3 不同处理组的青枯病害防治效果Tab. 3 Disease reduction of tobacco bacteria wilt in different treatment groups

2.3 拮抗菌株抗菌脂肽物质分析

2.3.1 拮抗菌脂肽粗提物对烟草青枯病菌的抑制作用

利用牛津杯法，以解淀粉芽胞杆菌FZB42 作为阳性对照，检测拮抗菌株GZYCT-4 和GZYCT-9 的脂肽粗提物对烟草青枯病菌的抑制作用，结果如图1 和表4 所示，GZYCT-4 和GZYCT-9 脂肽粗提物在100 µg/mL 浓度下，抑菌圈直径分别达到16.24 mm和20.71 mm，相同浓度的FZB42 脂肽粗提物对烟草青枯病菌的抑菌圈直径则为19.53 mm，供试拮抗菌脂肽提取物对烟草青枯菌的拮抗作用大小依次为GZYCT-9＞FZB42＞GZYCT-4，以GZYCT-9 的脂肽提取物对烟草青枯病菌的抑菌活性最强。

2.3.2 拮抗菌株生防标记基因的扩增结果

利用 8 对生防标记基因的特异引物[13]，通过PCR 检测拮抗菌株的部分生防标记基因，发现GZYCT-4 和GZYCT-9 菌株中均含有参与脂肽类家族细菌素（bmyB）、芬芥素（fenD）、伊枯草菌素（ituC）、表面活性素（srfAA、srf AB）以及生物素操纵子（bioA）和假定蛋白（yngG 、 yndJ）合成的基因（图2）。结果表明菌株GZYCT-4 和GZYCT-9 可能具有产生上述生防物质的能力。将扩增获得的特异条带回收纯化，克隆测序获得序列，利用BLASTX 将获得的序列与NCBI 数据库中相关蛋白质序列进行比对，结果发现，两个菌株与解淀粉芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的生防功能基因的蛋白质序列同源性在93%以上。两个菌株的部分生防功能基因如fenD和ituC的蛋白质序列系统进化树分析结果如图3 所示，GZYCT-4和GZYCT-9 的fenD 蛋白质序列均与解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens（KR149329.1）fenD 蛋 白质序列亲缘关系最近，而两个菌株的ituC 蛋白质序列与解淀粉芽孢杆菌ituC 蛋白质序列亲缘关系较近，由此可知，试验利用特异引物所扩增到的基因片段为相应的生防功能基因序列。

表4 拮抗菌株脂肽粗提物对烟草青枯病菌的拮抗作用Tab. 4 Antifungal activities of GZYCT-4 and GZYCT-9 lipopeptides against R. solanacearum

图 1 拮抗菌脂肽粗提物对烟草青枯菌的拮抗效果Fig. 1 Antifungal activities of GZYCT-4 and GZYCT-9 lipopeptides against R. solanacearum

图 2 GZYCT-4 和GZYCT-9 菌株生防标记基因扩增结果Fig. 2 Detection of Bacillussubtilis bio-control genes for GZYCT-4 and GZYCT-9 strains

图 3 GZYCT-4 和GZYCT-9fenD 和ituC 的蛋白质序列系统进化树Fig. 3 Protein sequence phylogenetic tree of GZYCT-4 and GZYCT-9 fenD and ituC

2.4 烟草根系分泌物及有机酸对拮抗菌根部定殖的影响

2.4.1 不同品种烟草根系分泌物中有机酸的组成

不同品种烟草根系分泌物的HPLC 检测结果以及根系分泌物含有的各种有机酸的含量分别如图3 和表5 所示，红花大金元以及K326 两个烟草品种的根系均能分泌草酸、苹果酸、柠檬酸和琥珀酸等有机酸，但是各有机酸的分泌量各不相同，其中，K326 和红花大金元两种烟草的根系分泌物中，琥珀酸的含量均最高，草酸的含量则稍低，且K326 分泌琥珀酸、柠檬酸、苹果酸以及草酸的能力强于红花大金元，其根系分泌物中上述四种酸的含量均明显高于红花大金元。此外，富马酸在红花大金元根系分泌物中含量为17.37 mg/kg，在K326 根系分泌物中没有检出，因此，在后期试验中，将选择草酸、苹果酸、柠檬酸和琥珀酸等四种有机酸进行拮抗菌的趋化研究。

表5 红花大金元和k326 根系分泌物中有机酸含量Tab. 5 Organic acid contents in root exudates of Dajinyuan and K326

2.4.2 烟草根系分泌物及其产生的有机酸对拮抗菌趋化性的影响

利用趋化性试验，探究烟草根系分泌物及其所含的各种有机酸对拮抗菌根部定殖的影响，结果如图4 所示，拮抗菌GZYCT-4 和GZYCT-9 均可利用红花大金元和K326 品种的根系分泌物及其所含的有机酸，但是拮抗菌对不同烟草品种的根系分泌物及其含有的有机酸的趋化程度各不相同。其中，GZYCT-4对红花大金元根系分泌物有较强的趋化反应，是其对K326 根系分泌物趋化反应程度的两倍左右；而GZYCT-9 对K326 根系分泌物的趋化反应大于红花大金元根系分泌物。

图4 不同烟草品种根系分泌物的有机酸液相色谱图Fig. 4 The HPLC chromatograms of organic acids in root exudate of different tobacco varieties

两种烟草根系分泌物含的草酸、苹果酸、柠檬酸及琥珀酸等四种有机酸中，草酸对GZYCT-4 的吸引作用最大，达到了61.50×105 cfu/mL，柠檬酸的影响次之，对GZYCT-4 吸引作用最弱的则是琥珀酸，仅为9.80×105cfu/mL；与此同时，对GZYCT-9吸引作用最大的是柠檬酸，达到了34.00 ×105cfu/mL，草酸的影响次之，而吸引作用最弱的则是琥珀酸，GZYCT-9 对其呈现负趋化反应。此外，由对照处理组可以看出，虽然GZYCT-4 的游动性明显低于GZYCT-9，但是GZYCT-4 对4 种酸的响应程度则远高于GZYCT-9。

图5 GZYCT-4 和GZYCT-9 菌对烟草根系分泌物和有机酸的趋化反应Fig. 5 Chemotactic response of GZYCT-4 和GZYCT-9 to root exudates and organic acids

3 讨论

具有生防能力的芽孢杆菌在国内外均有大量报道，其在多种植物体内以及根际土壤等生态环境中广泛存在[14-15]。生防芽孢杆菌不仅产生多种抗菌蛋白及脂肽类物质[16]，还可以促进作物生长，诱导作物产生系统抗病性。因其具有防病效果好、对人畜安全和无环境污染等优点而受到重视。目前，芽孢杆菌属中的一些微生物如多粘类芽孢杆菌已被我国农业农村部列为免做安全鉴定的一级菌种[17]。本试验所获得的2株对烟草青枯病菌具有较好拮抗作用的生防芽孢杆菌GZYCT-4 和GZYCT-9 分离自贵州地区的健康烟草根际土壤中，有效避免了有益微生物对环境的不适应性，保证了拮抗微生物的防治效果。将其接种至K326 和红花大金元烟株根际土壤，可显著降低烟草青枯病病情指数，防治效果和农用链霉素无明显差异。该结果与吴秉奇等[18]、刘艳霞[19]的研究相一致，表明从烟草根际土壤中分离微生物是获得生防菌的一种切实可行的方法。

芽孢杆菌作为重要的生物防治资源，其可通过[20]产生水解酶、抗菌脂肽等多种胞外代谢物质导致植物病原真菌菌丝畸形、原生质浓缩以及抑制抱子萌发[3]。已有大量研究报道芽孢杆菌属微生物通过非核糖体途径合成的脂肽类抗生素能够有效地控制植物病害，被认为是芽胞杆菌防治植物病害的重要机制之一[21]。目前已有许多关于芽胞杆菌产生的脂肽类物质防治植物病害的研究[22-23]。芽胞杆菌产生的抗菌脂肽主要包括表面活性素（surfactin）、枯草菌素（subtilin）、伊枯草菌素（iturins）、丰原素（fengycins）等[21,24]，伊枯草菌素和丰原素以其强烈的抗菌作用，可直接应用于植物病害的生物防治[4]；生物表面活性素虽无直接抗菌能力，但是可以加强伊枯草菌素等脂肽抗菌能力，并且生物表面活性素还能在植物的根部形成一层生物膜（biofilm），该膜能保护植物根部免受病原菌的入侵[25]。本研究获得的两株芽孢杆菌GZYCT-4 和GZYCT-9 均能扩增到细菌素（bmyB）、芬芥素（fenD）、伊枯草菌素（ituC）、表面活性素（srfAA、srfAB）等这些生防功能基因的目的片度，表明两个菌株均具有产生芽孢杆菌生防标记的潜能；且通过酸沉淀法获得的两株拮抗菌的脂肽类粗提物对烟草青枯病菌具有较强的抑制作用，这一结果暗示了GZYCT-4 和GZYCT-9 产生的抑菌物质在生物防治领域可能的应用潜力。但芽胞杆菌产生的脂肽类物质种类较多，菌株GZYCT-4 和GZYCT-9 对烟草青枯病菌的抑菌作用是多种脂肽类物质共同作用的结果，还是单一脂肽类物质的防病作用，仍需做进一步的验证和研究。

生防细菌要充分发挥其在防治植物病害中的作用，接种至土壤中的菌株能否在植物根际有效定殖对其作用的发挥至关重要[26]。通常，具有较强根际定殖能力的微生物都能很好的利用植株根系分泌物，适应植物的根际环境。细菌趋化性和生物膜形成能力已被认为是评判生防细菌定殖能力的两个重要指标[26-27]。趋化性作为生防细菌定殖过程中的重要步骤，主要通过对植物根系分泌物中特定物质的响应而实现[27]。研究发现，植株可分泌各种各样的糖、有机酸和次生代谢产物来调控根际微生物[28]，影响细菌在根际的趋化性和定殖能力，如Zhang 等人[29]发现B. subtilis N11 对香蕉根系分泌物的响应能力要显著的高于B.amyloliquefaciensSQR 9；拟南芥根系提取物和碳水化合物能显著影响芽抱杆菌胞外多聚物（EPS）合成基因的表达，从而影响芽抱杆菌的生物膜形成能力[30]。研究结果显示GZYCT-4 和GZYCT-9 均可利用红花大金元和K326 两种烟草品种的根系分泌物，但是对不同烟草品种的分泌物趋化能力则不相同。GZYCT-4 对红花大金元根系分泌物有较强的趋化反应，而GZYCT-9 则对K326 根系分泌物有较好的趋化反应，说明GZYCT-9 较GZYCT-4更易在烟草K326 品种上定殖，而GZYCT-4 在红花大金元烟草植株根际的定殖能力较强，这与试验过程中拮抗菌株GZYCT-4 和GZYCT-9 盆栽控病试验结果相符合。进一步的研究显示，GZYCT-4 对草酸、苹果酸、柠檬酸及琥珀酸等四种有机酸均具有正趋化性，其中，对草酸的趋化反应较强；而GZYCT-9则对烟草根系分泌物中的草酸、柠檬酸和苹果酸等三种有机酸均具有正趋化性，且对柠檬酸的趋化反应较大，究其原因，可能是有机酸中的诸如柠檬酸、苹果酸等多为三羧酸循环的中间产物，其可作为能源或信号物质影响生防细菌自身的三羧酸循环[31]，从而表现为生防菌对柠檬酸、苹果酸及草酸的趋化，此外，GZYCT-9 对烟草根系分泌物中的琥珀酸呈现负趋化作用，说明琥珀酸对于GZYCT-9 在烟草根际的定殖存在抑制作用。该试验结果初步明确了烟草根系分泌物及其含的有机酸对拮抗菌在烟草根部定殖的影响机制，为后期生防菌株的田间施用提供了一定的理论依据。

4 结论

从贵州省发病烟区的健康烟株根际土壤中分离纯化获得的GZYCT-4 和GZYCT-9 菌株，均为贝莱斯芽孢杆菌，对烟草青枯病菌具有较好拮抗作用，其抑菌圈直径分别为16.64 mm 和18.90 mm。两株烟草根际拮抗细菌施用到不同的烟草品种上，均能有效地防控烟草青枯病，降低其发病程度，且GZYCT-4 对红花大金元根系分泌物及其含有的草酸有较强的趋化反应，而GZYCT-9 则对K326 根系分泌物及其含有的柠檬酸有较好的趋化反应。