李静 王建红 张伊帆 王树伟

摘要 从自然染菌死亡的蚜虫体内分离得到一种杀蚜真菌，经鉴定为寄生曲霉（Aspergillus parasiticus），具有感染流行性，相对湿度75%以上，对蚜虫的侵染率达95%以上，对培养条件进行优化。结果表明，接种量为2.5%（重量比），玉米面和麸皮比例1∶1，水分含量60%，28 ℃，相对湿度80%，培养时间72 h ，产孢量最高达3.0×109 CFU/g;该株杀蚜真菌对蚜虫持效期达15 d以上，明显优于10%吡虫啉和40%毒死蜱防治效果。

关键词 蚜虫;生防;寄生曲霉;分离;防效

中图分类号 S433.39文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）22-0142-04

Abstract An killing fungus was isolated from aphids that died from natural infection.It was identified as Aspergillus parasitus of aphid fungus，which had infection prevalence.When the relative humidity was above 75%，the infection rate of aphid was above 95%.By optimizing the culture conditions，the test results showed that the inoculation amount was 2.5% （according to the weight ratio of liquid seeds and solid materials）; corn flour and bran ratio was 1∶1，moisture 60%，28 ℃，relative humidity 80%，72 h，the quantity of spore was 3.0×109CFU/g;the effort on aphid was more than 15 days，which was obviously better than the control effect of 10% Imidacloprid and 40% Chlorpyrifos.

Key words Aphid;Biocontrol;Aspergillus parasiticus;Isolation;Control effect

目前已发现的蚜虫约4 400种，共有10个科 [1]，蚜虫具有种类多、数量大、繁殖快、世代重叠、危害大、分布广、寄主杂等特点。以尖利的口器刺吸植物汁液，引起植物生长率降低，出现叶斑、泛黄、卷叶、枯萎等甚至死亡。据统计，2010—2011年我国26万hm2小麦中，有62.5%遭受了蚜虫的严重危害，尤其是麦长管蚜，造成华北平原、长江中游等地区小麦产量下降15%～60%[2]。蚜虫以群居方式吸取植株的养分且传播病毒病，间接危害严重，目前已知病毒的昆虫传播介体有600种，其中275种属于蚜虫，居世界传病毒昆虫之首，如桃蚜（Myzus persicae）是超过110种植物病毒的载体[3]。由于蚜虫危害严重，其防治措施的研究一直是植物保护研究工作的重大课题。

蚜虫的防治技术可分为化学防治、物理防治以及生物防治，化学防治仍是防治蚜虫的主要手段。化学方法防治蚜虫效果显著且使用方便，但会污染环境，破坏生态系统。物理方法防治蚜虫具有不产生抗性、无残留、对环境污染小等优点，还能较快降低蚜虫数量，可充分发挥天敌自然控蚜的能力。近年来，蚜虫生物防治技术受到广大学者的普遍关注，包括天敌、生防菌、植物源农药等[4-5]。

高效、安全、害虫不易产生抗药性的防治蚜虫微生物农药的开发及应用，已是各国植保工作者的研究重点。真菌、细菌、病毒等蚜虫病原性微生物也可广泛用于防治蚜虫，如白僵菌、绿僵菌、蜡蚧轮枝菌、菊欧文氏杆菌，禾谷缢管蚜病毒（RhPV）、链霉菌等病原微生物对蚜虫的防治均取得了显著效果[6-7]。昆虫病原真菌有显著的流行性及方便生产的特性[8-9]。笔者从自然染菌死亡的蚜虫体内分离出杀蚜真菌寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）并探索其最优培养条件，以期扩充杀蚜真菌的资源库、提高蚜虫生防真菌杀蚜广谱性，为开发新型杀蚜微生物农药提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 菌株來源

菌株来源于河南省郑州市徳谷元有机生态园区3号地块种植的萝卜叶片上发现染菌死亡的蚜虫，2016年11月12日09：30用无菌的塑料管采集感染蚜虫，密封后，常温保存带回实验室内，-20 ℃进行保存。

1.2 杀蚜菌株的筛选

1.2.1 培养基。PDA固体培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂 15～20 g、蒸馏水1 000 mL、pH 7.0。PDA液体培养基：PDA固体培养基中不加琼脂。

1.2.2 杀蚜菌株的分离纯化。

将采集的染菌死亡蚜虫，经75%乙醇浸泡30 min，用无菌蒸馏水清洗干净，PDA平板中加入20 μL Amp，直接将虫体放置于PDA固体平板中，于28 ℃培养72 h。

1.2.3 杀蚜菌株液体发酵。

在250 mL三角瓶中装入150 mL PDA液体培养基，121 ℃、0.15 MPa下灭菌30 min。将获得的纯种3号杀蚜菌株孢子接入灭菌后的PDA液体培养基中，置于28 ℃、150 r/min摇床中恒温培养24 h，得到杀蚜真菌的液体菌丝。

1.3 杀蚜真菌的固体发酵优化

设置不同碳氮比的固体物料进行固体发酵[10]，麸皮与玉米面（重量比）按照1∶1、1∶2、1∶3进行配比;水分按照55%、60%进行组合（表1），将液体发酵菌丝转接至经121 ℃灭菌60 min的固体发酵料上，28 ℃培养72 h，相对湿度75%以上。产生孢子后，经3 d自然风干，粉碎后获得杀蚜菌株的固体孢子粉，通过PDA平板活菌计数来确定最优的发酵组合[11-12]。

1.4 蚜虫防效测定

试验1：在郑州市中牟县德谷园蔬菜大棚内，供试作物品种是小西葫芦，选定被蚜虫寄生的区域。杀蚜菌株孢子粉与水稀释比按照1∶500、1∶750、1∶1 000倍稀释，并设置清水空白对照。每个试验处理小区面积15 m2，重复3次试验，小区随机区组排列，采用背负式手动喷雾器喷雾，喷液量为600 kg/hm2，于傍晚前喷雾并保证棚内相对湿度≥85%。为了防止处理间相互干扰，施药时用塑料膜遮隔相邻小区。处理前在小区内5点取样，每个点选2株植株，并在选定植株上标定3片无翅成蚜寄生量不少于50头的叶片，调查虫口基数，于处理后3、5、7 d统计蚜虫数量，计算防治效果，具体计算公式：

虫口减退率=（处理前虫口基数-处理后各天残留虫数）/处理前虫口基数×100%[13]

防治效果=（处理区虫口减退率-对照区虫口减退率）/（100-对照区虫口减退率）×100%[14]

试验2：在河南安阳棉花基地，供试作物品种是棉花蚜虫。杀蚜菌株与水稀释比按照1：750倍稀释（作为A组），以清水（作为CK）、化学农药10%吡虫啉（作为B组）和40%毒死蜱（作为C组）进行防效试验对比。每个试验处理小区面积15 m2，重复3次试验，小区随机区组排列，采用背负式手动喷雾器喷雾，喷液量为600 kg/hm2。为了防止处理间相互干扰，施药时用塑料膜遮隔相邻小区。处理前在小区内5点取样，每个点选2株植株，并在选定植株上标定3片无翅成蚜寄生量不少于50头的叶片，调查虫口基数，于处理后3、5、7、15 d统计蚜虫死亡情况，计算防治效果，具体计算公式：

虫口减退率=（处理前虫口基数-处理后各天残留虫数）/处理前虫口基数×100%

防治效果=（处理区虫口减退率-对照区虫口减退率）/（100-对照区虫口减退率）×100%

1.5 杀蚜菌株鉴定

形态学鉴定：观察菌株培养特征、菌落形态，显微镜观察菌丝及孢子形态特征。参照《真菌鉴定手册》[15]进行形态学鉴定。分子生物学鉴定：提取目的菌株基因组DNA，以通用引物进行PCR 扩增。引物序列为 ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGC;ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC;PCR反应条件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35 个循环;72 ℃ 10 min。扩增产物进行 1.0% 琼脂糖凝胶电泳分离、检测，切胶纯化后送至上海生工科技有限公司测序，所得 18S rDNA 基因序列在NCBI数据库中进行Blast基因同源性比对。

2 结果与分析

2.1 分离结果

在PDA平板中出现4种不同真菌菌落，用接种针分别将上述4株菌挑取到PDA平板中进行纯化。将纯化后的4株菌株分别再进行平板产孢培养，72 h后，制成相同浓度的孢子悬浮液100 mL（添加0.2%的吐温80），对萝卜蚜虫进行喷雾，选出3号菌株对蚜虫具有杀灭作用，得到具有杀蚜活性的纯化菌株。

2.2 杀蚜真菌的固体发酵孢子含量

按照2%接种量接种到不同碳氮比、水分固体物料上，28 ℃培养72 h，相对湿度75%以上，产生孢子后，经过3 d的自然风干，粉碎后获得杀蚜菌株的固体孢子粉，采用PDA平板活菌计数方法[16]，统计分析有效活菌数，结果见表2。由表2可知，固体发酵料组合Ⅳ对于发酵杀蚜真菌而言最适合，有效活菌含量达3.0×109 CFU/g，是较理想的杀蚜真菌固体发酵料。

2.3 蚜虫防效分析

在大棚西葫芦和露天棉花上进行蚜虫的防治效果试验，通过蚜虫减退率和防效2个技术指标，确定该菌株使用稀释浓度（含量），与化学杀蚜农药进行对比，比较该株菌剂对蚜虫的持续控制时间[17-21]。不同稀释比例的杀蚜菌株对西葫芦蚜虫的防治效果见表3，杀蚜菌株与化学农药蚜虫防效比较见表4。

从表3可以看出，喷雾处理3 d后，稀释倍数1∶500与稀释倍数 1∶750的寄生曲霉菌孢子粉产品对蚜虫的防治效果差异不显著，而稀释倍数1∶500和1∶750与稀释倍数1∶1 000的寄生曲霉菌孢子粉产品存在显著差异。同时，喷雾处理后3 d稀释倍数1∶500与 1∶750蚜虫防效均在90%以上，稀释倍数1∶1 000的蚜虫防效也在89%以上。表明寄生曲霉对蚜虫的防治效果显著，说明喷施5 d后蚜虫基本均被感染，7 d后也是持续控制状态。

1∶750杀蚜菌株对棉蚜有明显的控制效果，1～3 d后，杀蚜菌株与10%吡虫啉和40%毒死蜱差异不显著，随着处理时间的延长，处理5～15 d后，其防效维持在98%以上，与10%吡虫啉和40%毒死蜱防治效果存在显著差异。

2.4 杀蚜菌株的鉴定结果

所得菌落初为白色，黄绿色，继而变成黄褐色，分生孢子头呈放射形，少有疏松柱状，分生孢子梗多为单层，少有双层，分生孢子椭圆形（图1、2）。将在固体培养基中培养3～5 d后得到的菌株菌落，提取其基因组DNA，并采用常规的寄生曲霉菌DNA扩展引物对该DNA进行扩增，并分别用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，切割所需DNA目的条带对该菌株ITS DNA序列的PCR产物进行测序，通过NCBI数据库中Blast基因同源性比对，该菌株与曲霉属（Aspergillus）的寄生曲霉（Aspergillu sparasiticus）基因同源性概率達98%以上，综合该菌株的菌落形态、分生孢子形态、培养条件及分子生物学鉴定结果表明，该菌株属于曲霉属（Aspergillus）的寄生曲霉（Aspergillu sparasiticus）。

3 讨论

蚜虫病原真菌主要分布在接合菌亚门和半知菌亚门。在接合菌亚门真菌中，虫霉目（Entomophthorales）真菌是一类世界性广布的虫生真菌，在控制蚜虫方面占有重要地位。据统计，到目前为止，在虫霉目中以蚜虫为寄主的种类有6属21种[22]。卷枝毛霉（Mucorcircinelloides Van Tieghem）对蚜虫（Entalonia nigronervosa Coq）具有较好的致死效果，在蚜虫生物防治中应用最广的真菌杀虫剂是蜡蚧轮枝菌（V.lecanii），属于半知菌亚门，在热带、亚热带和温带都有分布[23]。蜡蚧轮枝菌寄主范围广，主要在蚧壳虫和蚜虫上。虫生镰刀菌 （Fusarium sp.） 在自然界普遍分布，在一定条件下对控制蚜虫种群起着重要作用[24]。寄生曲霉 （Aspergillus parasiticus）、金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）、青霉 （Pencillium sp.）、球孢白僵菌 （Beauveria bassiana）、粉质拟青霉 （Paecilomyces farinosus）和布氏白僵菌（B.brongniartii）侵染蚜虫的报道也不少，鲜见成熟应用的案例。

该研究从自然感染死亡的蚜虫体中，分离出具有杀蚜活性的寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）菌株，采用固体发酵产生孢子，高含量的孢子粉作为侵染单元，通过在小西葫芦上瓜蚜进行生防试验以及在棉田中对棉蚜的防治效果进行试验，结果显示该菌株表现出较强的侵染力和持续控制力，持效期长达15 d以上。扩充杀蚜真菌的资源库、提高蚜虫生防真菌杀蚜广谱性，为开发新型杀蚜微生物农药提供技术基础。

参考文献

[1] 张永军，刘爱英，梁宗琦.真菌在蚜虫生物防治中的研究进展[J].贵州农业科学，1998，26（3）：59-62.

[2] XIA L Q，MA Y Z，HE Y，et al.GM wheat development in China：Current status and challenges to commercialization[J].Journal of experimental botany，2012，63（5）：1785-1790.

[3] NAULT L.Arthropod transmission of plant viruses：A new synthesis[J].Annals of the entomological society of America，1977，90（5）：521-541.

[4] 李娟，安德荣.捕杀特黄板对烟蚜及烟田蚜传病毒病防治效果的研究[J].中国烟草学报，2010，16（2）：70-72.

[5] 陆剑飞，郑永利，夏永锋.蔬菜主要害虫抗药性发展现状与治理对策探讨[J].农药科学与管理，2004，52（2）：10-13.

[6] GRENIER A M，DUPORT G，PAGS S，et al.The phytopathogen Dickeya dadantii （Erwinia chrysanthemi 3937）is a pathogen of the pea aphid[J].Applied and environmental microbiology，2006，72（3）：1956-1965.

[7] COSTECHAREYRE D，BALMAND S，CONDEMINE G，et al.Dickeya dadantii，a plant pathogenic bacterium producing cytlike entomotoxins，causes septicemia in the pea aphid Acyrthosiphon pisum[J].PLoS One，2012，7（1）：1-9.

[8] MILNIER R J.Prospects for biopesticides for aphid control[J].Entomophaga，1997，42（1/2）：227-239.

[9] VANDENBERG J D，SANDVOL L E，JARONSKI S T，et al.Efficacy of fungi for control of Russian wheat aphid （Homoptera：Aphididae） in irrigated wheat[J].Southwest Entomol，2001，26（1）：73-85.

[10] 刘金国，涂璇，涂晓嵘，等.种子工艺优化对链霉菌702发酵产抑真菌生物活性物质的影响[J].江西科学，2007，25（3）：253-257.

[11] 沈萍，范秀荣，李广武.微生物学实验[M].北京∶高等教育出版社，1996.

[12] 李贵正，张营，郑树林，等.蓝光和黑暗培养淡紫拟青霉形态及产孢量差异[J].湖北农业科学，2018，57（4）：36-38.

[13] 梁宗琦.昆虫病原真菌的毒力[M]//《杀虫微生物》编委会.杀虫微生物：第2卷.北京：中国农业科技出版社，1989：11-18.

[14] 蒲蛰龙，李增智.昆虫真菌学[M].合肥：安徽科学技术出版社，1996.

[15] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979：235-241.

[16] 李爱华，岳思君，马海滨.真菌孢子三种计数方法相关性的探讨[J].微生物学杂志，2006，26（2）：107-110.

[17] 于晓庆.防治小麦田蚜虫高效药种[J].农药市场信息，2018（5）：52.

[18] 周建如，张永军.高毒力杀蚜真菌菌株筛选[J].植物医生，2003，16（2）：31-33.

[19] 唐启义，冯明光.实用统计分析及其DPS数据处理系统[M].北京：科学出版社，2002：1-8.

[20] 顿玉慧，冯明光，应盛华.新型球孢白僵菌孢子悬乳剂的高效杀蚜活性及其评价方法[J].微生物学报，2003，43（6）：78l-787.

[21] FENG M G，LI H P.Experimental epizootiology of Zoophthora anhuiensis （Entomophthorales） against Mypus petsicse（Homoptera：Aphididae） with a description of a modified Gompertz model for aphid epizooticd[J].Eaviron Microbiol，2003，5（11）：1203-1211.

[22] 王未名.蚜虫寄生真菌-诺氏虫疫霉[M]//中国植物学会真菌学会虫生真菌专业组.中国虫生真菌研究与应用：第1卷.北京：学术期刊出版社，1988：153-155.

[23] 陳吉棣.蜡蚧轮枝菌及其在生防中的应用[J].生物防治通报，1985，1（4）：32-37.

[24] 李宏科.虫生镰刀菌的初步研究[M]//中国植物学会真菌学会虫生真菌专业组.中国虫生真菌研究与应用：第1卷.北京：学术期刊出版社，1988：211-255.