王思蕲 曹小勇 胡选萍 秦公伟 赵垚

摘要：以建兰不同发育状态种子为材料，通过无菌播种的方法，研究种子成熟度（授粉后60d、90d、180d、270d、360d、480d的种子，下文授粉后天数用DAP表示），液体与固体培养方式以及植物生长调节剂6-BA，NAA等因素对种子萌发的影响。结果表明：DAP60种子未萌发，DAP90、DAP180、DAP270种子的萌发率高于DAP360、DAP480种子;液体培养基中种子萌发率为39.56%高于固体培养基萌发率23.47%;6-BA与NAA都可促进建兰种子萌发，且萌发率随着激素浓度增加而升高，种子在1/2MS+6-BA 2mg/L中萌发率达到96.27%，且萌发指数优于NAA及其它浓度6-BA。

关键词：建兰;种子成熟度;固液培养;6-BA;NAA

中图分类号：S-3  文献标识码：ADOI：10.19754/j.nyyjs.20200229007

建兰（Cymbidium ensifolium），又名四季兰，为兰科兰属多年地生草本植物，生于海拔600～1800m的山谷、疏林、灌丛或草丛中，广泛分布于东南亚和南亚各国。我国主要产地有浙江、福建、广东、海南等。叶片宽1cm左右，长40～60cm，形状如剑，花多葶长，花清香，花梗和花瓣多数为淡黄色，唇瓣上有暗点紫块，在我国有悠久的栽培历史[1，2]。

建兰单个蒴果内具有大量种子，和其它兰科植物相似其种子细小，无胚乳，种子发育缓慢，萌发率低[3-5]。目前，对建兰组织培养研究主要在茎尖与侧芽诱导原球茎[6-9]、根状茎增殖与分化[10-12]、花芽诱导[13]、遗传多样性分析[14，15] 等方面。同时，建兰不同种子成熟度与萌发率的关系未见报道。因此，本试验通过研究建兰种子成熟度、液体与固体培养方式、植物生长调节剂6-BA及NAA对萌发的影响，确定适合建兰种子萌发的培养基，以提高种子萌发率，为推进建兰离体培养的效率提供技术支持。

1材料和方法

1.1材料

建兰植株培养于陕西理工大学生物科学与工程学院实验准备室，2017年9月—2018年6月盛花期进行人工授粉，2019年1月8日首个果实开裂成熟，从授粉到果实成熟需要约480d。选取DAP60、DAP90、DAP180、DAP270、DAP360、DAP480的无菌种子用于不同成熟度种子萌发的培养，DAP360用于液体、固体培养基与不同浓度6-BA、NAA培养。

1.2培养方式与培养条件

采用液体、固体培养方式，以30mL的玻璃螺口顶空瓶为培养容器，每瓶内培养基约为10～15mL，每个处理重复3次，培养温度25±1℃，种子激素处理暗培养，其他处理光照强度1000～2000Lx，光照12h/d。

1.3试验方法

1.3.1建兰果实消毒

果实采收后，去除干枯花瓣，用毛笔粘上肥皂刷洗果皮，流水冲洗2h后移入超净工作台，用75%酒精浸泡30s，0.1%升汞消毒15min，无菌水清洗3次，在无菌培养皿中切去多余果柄、干枯合蕊柱后，切分果实，得到的种子作为实验材料。

1.3.2不同成熟度种子培养

以1/2MS液体培养基为萌发培养基。分别将不同发育时期的无菌种子均匀播种至培养基内150d后，统计各时期种子萌发（萌发为种子发育至下文B阶段）数量。

1.3.3液体、固体培养

将无菌种子均匀播种于1/2MS固体、液体培养基中360d后，统计萌发种子数量。固体培养基中添加7g/L琼脂，液体培养基不添加琼脂。每瓶种子数量约为70～200粒。

1.3.4不同浓度6-BA与NAA培养

将无菌种子均匀播种于以下7种液体培养基中：（A1）：1/2MS（对照组）; （A2）：1/2MS+0.1mg/L 6-BA;（A3）：1/2MS+1mg/L 6-BA;（A4）：1/2MS+2mg/L 6-BA;（A5）：1/2MS+0.1mg/L NAA;（A6）：1/2MS+1mg/L NAA;（A7）：1/2MS+2mg/L NAA。培养360d后，统计种子萌发数量。每瓶种子数量约为70～200粒。

1.4萌发指标计量

萌发率=B+C+D+EA+B+C+D+E×100%

萌发指数=10B+20C+30D+40EA+B+C+D+E×100%

ABCDE分別表示建兰种子萌发过程5个阶段（未萌动、膨大、突破种皮、伸长、分叉）。

A：种胚未萌动，胚的长度小于0.19cm;

B：种胚膨大但未突破种皮，胚的长度0.19～0.23cm;

C：原球茎突破种皮，原球茎长度0.24～0.35cm;

D：根状茎大部分已突破种皮或与种皮分离，此阶段许多根状茎变成绿色，长度大于0.35cm;

E：一个根状茎上的分叉数量大于1。

通过对种子萌发各阶段数量统计，得到萌发指数。

1.5统计分析

采用Microsoft Excel 2007、SPSS19.0和Prism 5对试验结果进行统计学分析。

2结果与分析

2.1种子成熟度对萌发的影响

建兰种子的成熟度显著影响种子的萌发数量，成熟度低以及完全成熟的种子萌发数量均较低。DAP60的蒴果瘦小，其宽度与DAP90-480蒴果存在明显差异，解剖蒴果种子白色，细小，紧贴于胎座组织，在培养基上未萌发;DAP90种子白色，细小，可见发育较小的胚，在培养基上出现萌发;DAP180种子白色，伸长呈絮状，显微镜下可见明显胚体，在培养基上出现萌发;DAP270-480种子黄白色，粉状，均在培养基上出现萌发，蒴果的宽度随着生长时间的延长逐渐增加。DAP90、DAP180、DAP270种子萌发数量高于DAP60、DAP360、DAP480，说明建兰种子成熟度对种子萌发有较大影响。

DAP/d蒴果 Capsule重量/g宽度/cm特征种子特征萌发数量601.150.91深绿色，饱满白色，细小，紧贴于胎座组织/902.191.18深绿色，饱满白色，细小，紧贴于胎座组织++1802.181.26深绿色，饱满白色，絮状++2701.731.36深绿色，饱满黄白色，粉状++3603.421.90深绿色，饱满黄白色，粉状+4803.361.96尖端褐色，干枯开裂黄白色，粉状+注：因早期建兰种子细小并粘黏在一起，不能精确统计种子数量，所以无法得出具体的萌发率，用“/”代表无萌发，“+”代表萌发数量，“+”越多，萌发数量越多。

2.2液体、固体培养方式对建兰种子萌发的影响

液体、固体培养方式对建兰种子的萌发影响较大，液体培养方式种子的萌发率为39.56%，较固体培养萌发率23.47%更高。在液体培养基中种子充分接触水与营养物质，同时稀释了种子萌发抑制物，从而促进种子萌发[21]。因此在本试验中，液体培养基较固体培养基更能提高建兰种子的萌发率。

2.3不同浓度6-BA与NAA对建兰种子萌发的影响

不同浓度6-BA与NAA对建兰种子萌发率影响均有显著性差异。不添加任何外源植物生长调节剂时，种子也可萌发，萌发率为16.43%。添加不同浓度6-BA与NAA后，可明显提高种子的萌发率，随着6-BA与NAA浓度的增加，萌发率和萌发生长指数逐渐增加，在浓度为2mg/L时，种子的萌发率可分别达到96.27%、95.84%，极显著高于对照组，较对照组增加了486%、483%;种子的萌发指数可分别达到27.76、20.82，远高于对照组，较对照组增加了658%、469%，这说明2mg/L 6-BA与NAA都能显著提高种子萌发率，且种子在2mg/L 6-BA中萌发后的生长速度更优。因此，建兰种子适宜萌发的培养基为1/2MS+2mg/L 6-BA+25g/L蔗糖（暗培养）。

3讨论

成熟度是兰科植物种子萌发的影响因素之一，许多兰科植物种子完全成熟后种子的萌发率远低于未成熟种子。本实验研究表明，建兰种子不同发育阶段对其萌发有较大影响：DAP60种子过于细小、幼嫩，尚无萌发;DAP360及以后的种子萌发率低于DAP90、DAP180、DAP270种子，这说明建兰种子过于幼嫩或高度成熟均不利于种子萌发，此研究结果与大花杓兰（C. macranthum）、小叶兜兰（P. barbigerum）、C. reginae、黄花杓兰 （C. flavum）结果相似。相关研究发现，内源性脱落酸浓度随着种子成熟度的增加而增加，高浓度的脱落酸是阻碍种子萌发的主要因素，这可能是导致该现象的原因之一。Yamazaki and Miyoshi认为，在种子成熟过程中木质素等物质在胚胎周围的内珠被积累，对诱导成熟种子休眠具有重要作用。也有人认为，兰科植物种子在成熟过程中内种皮会变成一层“Carapace”的封闭结构，从而导致成熟种子的种皮渗透性差，种子萌发困难。因此，成熟种子内的抑制萌发物质，或种皮渗透性差，抑或是以上因素共同作用引起种子休眠，降低了成熟种子萌发率;过于幼嫩种子可能由于胚发育不完全，而未发生萌发。

虽然建兰种子在液体培养基中萌发率更高的结果与Zeng S、丁长春关于兜兰的研究结果一致，但液体培养方式不一定适合所有兰科植物种子。这可能是因为液体培养存在缺少氧气及长时间培养营养不足的问题。因此在液体培养的过程中可以减少液体培养的时间、定期加入营养液并及时将萌发的原球茎转接至固体培养基中，从而促进种子萌发及萌发后原球茎的健康生长。

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