唐保露张 旭袁 萍朱元美杨解人郑书国

（皖南医学院药理学教研室，安徽 芜湖241002）

糖尿病前期是糖代谢稳态与糖尿病之间的过渡状态，其血糖虽出现异常，但尚未达到糖尿病诊断标准，主要表现为空腹血糖升高和糖耐量降低。虽然糖尿病前期无明显临床症状，但它是糖尿病的高危因素，许多心脑血管并发症在此阶段也已发生［1］。中国是糖尿病大国，成年人糖尿病患病率为11.6%，处于糖尿病前期的人群比率更是高达50.1%，如不及时采取积极有效的防控措施，糖尿病发病率将迅速上升，糖尿病防治形势异常严峻［2］。

糖尿病前期是糖尿病发生发展的必经阶段，是一种可逆状态［3］。临床资料显示，控制饮食、增加运动等生活方式干预可明显降低糖尿病前期发展为2 型糖尿病的风险［4］。然而，由于大多数患者对生活方式干预依从性较差，尤其是部分高危人群，亟需采取更为有效的干预措施，以延缓或阻止2 型糖尿病的发生发展。中医药在糖尿病防治方面具有丰富的理论基础和临床经验，尤其是糖尿病前期，更是中医药发挥作用的关键阶段。临床实践表明，脾虚是糖尿病前期的基本病机，益气健脾可有效改善糖尿病前期状态，预防糖尿病发生发展［5］。本研究依据文献方法采用高糖高脂饮食诱发大鼠糖尿病前期［6］，观察益气健脾经典方药四君子汤对糖尿病前期的改善作用并探讨其可能机制，以为临床应用益气健脾方药防治2 型糖尿病提供依据。

1 材料

1.1 动物 SPF 级SD 大鼠，体质量（200±20）g，购于浙江省实验动物中心，生产许可证号SCXK（浙）2014-0001，使用许可证号 SYXK（浙）2014-0008。普通大鼠饲料和高糖高脂饲料（普通饲料74%，猪油10%，蔗糖10%，蛋黄粉5%，胆固醇1%）购于南京市江宁区青龙山实验动物繁殖中心。

1.2 药物与试剂 四君子颗粒（批号20180516）购自李时珍医药集团有限公司。血糖仪及血糖试纸（批号20170303）购自三诺生物传感股份有限公司；血清胰岛素（批号20180905）、糖化血红蛋白（glycated hemoglobin，GHb，批号20180906）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（批号20181130）购自南京凯基生物科技发展有限公司；RIPA 裂解液（批号051018180717）、蛋白酶和磷酸酶抑制剂（批号051018180635）、蛋白测定试剂盒（批号101518181113）、GRP78抗体（批号120617180313）、ATF4 抗体（批号011018180606）购自碧云天生物技术有限公司；p-PERK（批号86w3361）、PERK（批号66r8853）、CHOP 抗体（批号57c6807）购自美国Affinity Biosciences 公司；β-actin 抗体（批号20180926）购自博士德生物工程有限公司；ECL 发光试剂盒（批号20180822）购自上海天能科技有限公司。

1.3 仪器 Infinite 200 PRO 酶标仪（瑞士Tecan 公司）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；DYY-6C 型电泳仪（北京六一仪器厂）；Mini PROTEAN 转膜仪（美国Bio-Rad 公司）；Fluor chem FC3化学发光凝胶成像系统（美国Protein Simple 公司）。

2 方法

2.1 造模、给药 SD 大鼠适应性喂养1 周，随机分为正常组、模型组、四君子颗粒高、低剂量组（10.5、5.25 g／kg）。正常组喂饲普通饲料，其余各组给予高糖高脂饲料，四君子颗粒各组每天灌胃给予相应剂量四君子颗粒，正常组和模型组灌胃等体积蒸馏水，连续灌胃10 周。其间每周称定大鼠质量，并根据其体质量调整给药量。

2.2 生化指标检测 分别在给药的第2、4、6、8、10 周末，禁食12 h，眼眶静脉丛采血，测定空腹血糖（Fasting blood-glucose，FBG）和糖化血红蛋白（glycated hemoglobin，GHb）水平。分离血清，ELISA 法测定空腹胰岛素（fasting serum lisulin，FINS）水平，计算胰岛素抵抗指数（Homa-IR）＝［FBG（mmol／L）× FINS（mU／L）］／22.5。

2.3 胰岛细胞凋亡检测 第10 周末，腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg／kg）麻醉，取大鼠胰腺，留取部分胰尾组织用4%多聚甲醛固定，其余胰腺组织用生理盐水漂洗，滤纸吸干水分，放入-80 ℃冰箱冻存，用于免疫印迹检测。取4%多聚甲醛固定的胰腺组织，梯度酒精脱水，常规石蜡包埋、切片乙醇（5 μm），按照试剂盒说明书进行TUNEL 染色，显微镜下观察、拍照，细胞核呈棕色为凋亡阳性细胞。

2.4 Western blot 检测 取胰腺组织，RIPA 裂解液（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂）冰浴裂解，12 000 g、4 ℃离心15 min，收集上清液，BCA 法测定蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白、转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h 后，分别放入抗GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、CHOP、β-actin 抗体4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤后加入二抗，室温孵育2 h，ECL 发光液显色，凝胶图像分析系统拍照并分析条带光密度，结果以GPR78／β-actin、ATF4／βactin、CHOP／β-actin、p-PERK／PERK 表示蛋白表达相对量。

2.5 统计学分析 采用DAS1.0 统计软件进行分析，计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK 法。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 四君子颗粒对糖尿病前期大鼠FBG、GHb、FINS 和Homa-IR 的影响 如图1 所示，喂饲高糖高脂饲料6 周后，大鼠FBG、GHb、FINS 水平和Homa-IR 升高（P＜0.05，P＜0.01），提示大鼠已进入糖尿病前期状态，并伴有明显胰岛素抵抗。同时给予四君子颗粒后，大鼠FBG、GHb、FINS 水平和Homa-IR 低于模型组（P＜0.05，P＜0.01），提示四君子颗粒可显著改善高糖高脂饲料诱发的大鼠糖尿病前期，减轻胰岛素抵抗。

图1 四君子颗粒对糖尿病前期大鼠FBG、GHb、FINS 水平及Homa-IR 的影响（， n＝7）Fig.1 Effects of Sijunzi Granules on levels of FBG，GHb，FINS and Homa-IR in prediabetic rats（， n＝7）

3.2 四君子颗粒对糖尿病前期大鼠胰岛细胞凋亡的影响 由图2 所示，正常组大鼠胰岛极少出现TUNEL 染色阳性细胞，而喂饲高糖高脂饲料10 周后胰岛染色阳性细胞明显增加，提示胰岛细胞凋亡增加。给予四君子颗粒的大鼠胰岛染色阳性明显减少，提示四君子颗粒可明显减轻高糖高脂饲料诱发的大鼠胰岛细胞凋亡。

图2 四君子颗粒对糖尿病前期大鼠胰岛细胞凋亡的影响（×400）Fig.2 Effect of Sijunzi Granules on islet cell apoptosis in prediabetic rats（×400）

3.3 四君子颗粒对胰腺组织内质网应激相关蛋白表达的影响 如图3 所示，喂饲高糖高脂饲料10周后，大鼠胰腺组织内质网应激标志蛋白GRP78表达升高（P＜0.01），PERK 蛋白磷酸化及其下游因子ATF4 蛋白表达升高（P＜0.01），提示高糖高脂饮食诱发了明显内质网应激状态。同时，作为内质网应激途径诱导细胞凋亡的关键因子CHOP 表达升高（P＜0.01）。给予四君子颗粒可降低GRP78 蛋白、PERK 蛋白磷酸化和ATR4、CHOP蛋白表达（P＜0.05，P＜0.01），提示四君子颗粒可有效抑制高糖高脂饮食诱发的内质网应激状态，这可能是其减少糖尿病前期大鼠胰岛细胞凋亡的机制之一。

4 讨论

糖尿病前期是2 型糖尿病发生发展过程中的必经阶段，表现为空腹血糖升高和糖耐量降低。由于肥胖等多种因素的影响，机体对胰岛素的敏感性降低，致使血糖水平升高。高血糖进一步诱发胰岛素分泌增加，出现以高血糖、高胰岛素血症等为特征的胰岛素抵抗状态。中医学认为，糖尿病的发生发展与脾胃关系密切，“脾虚致消”“健脾愈消”理论在2 型糖尿病的治疗中发挥重要作用［7］。本研究依据“脾虚致消”理论，采用高糖高脂饮食喂饲大鼠，以达“过食肥甘，损伤脾胃”之目的，以建立大鼠糖尿病前期模型。至6 周末，大鼠空腹血糖水平和空腹胰岛素水平均明显升高，但尚未达到糖尿病诊断标准，胰岛素抵抗指数也显著升高，提示大鼠已进入糖尿病前期状态。随着喂饲时间的延长，大鼠糖尿病前期状态更为明显。给与四君子颗粒可显著减轻高糖高脂饮食诱发的空腹血糖升高和糖耐量降低，改善胰岛素抵抗，说明四君子颗粒可明显改善大鼠糖尿病前期状态。

图3 四君子颗粒对胰腺组织内质网应激相关蛋白表达的影响（， n＝4）Fig.3 Effects of Sijunzi Granules on the expression of endoplasmic reticulum stress-related proteins in pancreatic tissue（， n＝4）

在糖尿病前期阶段，由于机体对胰岛素敏感性下降，血糖水平明显升高，进一步刺激胰岛β 细胞分泌胰岛素，加重β 细胞负担。长期高负荷分泌胰岛素可诱发胰岛β 细胞内质网应激［8］。GRP78 是重要的内质网分子伴侣，生理情况下，GRP78 与内质网应激信号感受器IRE1、PERK 和ATF6 蛋白结合，使其处于失活状态［9］。当胰岛素合成大量增加时，超过内质网加工能力，激发未折叠蛋白反应，后者可诱导GRP78 蛋白表达代偿性增加，这是内质网应激的标志性事件［10］。本研究结果显示，糖尿病前期大鼠胰腺组织GRP78 蛋白表达显著增加，PERK 蛋白磷酸化水平明显升高，同时其下游转录因子ATF4 表达水平也显著上调，提示糖尿病前期大鼠胰腺组织细胞发生内质网应激。给予四君子颗粒可显著减少糖尿病前期大鼠胰腺组织GRP78 蛋白表达水平，下调PERK 磷酸化及ATF4 蛋白表达水平，提示四君子颗粒可有效改善糖尿病前期大鼠胰腺组织细胞内质网应激状态，抑制PERK 信号通路的激活。

CHOP 是内质网应激特异性转录因子。当发生内质网应激时，PERK、IRE1 和ATF6 信号途径的激活均可诱导CHOP 表达上调，其中PERK-eIF2α-ATF4 通路是CHOP 蛋白表达的主要调节途径［11-12］。CHOP 可通过多种途径诱导细胞凋亡［11］。本研究结果显示，糖尿病前期大鼠胰腺组织CHOP表达显著升高，同时胰岛细胞凋亡也明显增加，这一结果与胰腺组织内质网应激PERK-ATF4 信号通路的激活一致，提示糖尿病前期大鼠胰岛细胞凋亡增加与内质网应激有关。给予四君子颗粒可明显抑制PERK-ATF4 信号通路激活，下调CHOP 蛋白表达水平，减少胰岛细胞凋亡，提示四君子颗粒减少胰岛细胞凋亡与抑制内质网应激信号PERK-ATF4-CHOP 信号通路有关。

综上所述，益气健脾方药四君子颗粒可有效改善大鼠糖尿病前期状态，降低空腹血糖水平，提高葡萄糖耐量，其机制可能与四君子颗粒改善糖尿病前期大鼠胰岛素抵抗、抑制内质网应激及其诱导的胰岛细胞凋亡有关。