朱芳贤，张晋青，莫延新，隋鹤鸣，谢秀梅,孟 飞，补海平，王廷艳，赵俊金*

(1.全国畜牧总站，北京 100193；2.青海省家畜改良中心，西宁 810016)

超数排卵是制作胚胎的一个重要环节，对于供体来说是一个复杂的生理过程，因不同品种、不同个体、不同药物和不同生态环境，超数排卵效果也各异。桑润滋和陈静波[1]总结了我国2010年以前绵羊超数排卵结果发现，美利奴超细毛羊超数排卵获得可移植胚胎数量平均为5.83～6.56枚/次，肉用绵羊为6.98～9.77枚/次；郭延华等[2]、张帆等[3]近几年的报道肉用绵羊可移植胚胎数量也在这个范围。张静芳等[4]、朱芳贤等[5]报道地方品种绵羊获得可移植胚胎数量平均为4.0～5.0枚/次，如何提高地方品种的超数排卵效果有待研究。本文分析了青海藏羊超数排卵效果，筛选出适合生产应用的超排技术，为提高青海藏羊品种资源保护及实施良种羊高效扩繁技术提供参考，对提高青藏高原羊品质及养殖效益具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供体羊

从青海省青海藏羊主产区挑选纯种优秀高原型、山谷型、欧拉型青海藏羊在青海省家畜改良中心西宁示范基地开展保种胚胎制作。高原型公羊15只、母羊60只，山谷型公羊15只、母羊50只，欧拉型公羊15只、母羊50只。公羊年龄2～5岁，母羊的年龄1.5～3.5岁、2～4胎。

1.2 主要药品与器械

加拿大(CAN)产Follitropin 促卵泡素(FSH)，400 mg/支；日本(JP)产FSH，10 AU×5支；促黄体素释放激素A3(促排3号)由宁波三生药业有限公司生产，20 μg×10支；氯前列烯醇(PG)，上海市计划生育科学研究所生产，0.2 mg/2 mL/支；黄体酮阴道缓释剂(CIDR)，新西兰DEC国际有限公司生产，1.9 g/支。

1.3 试验设计

高原型藏羊给予200 mg(A组)、240 mg(B组)、280 mg(C组)3个不同CAN FSH剂量，分别处理13只、12只、12只羊；对高原型藏羊经过3个月恢复期后再给予16.0 AU(D组)、20.0 AU(E组)、24.0 AU(F组)3个不同JP FSH剂量，分别处理6只、18只、10只羊；对欧拉型藏羊给予216 mg(G组)、256 mg(H组)、276 mg(I组)3个不同CAN FSH剂量，分别处理16只、15只、14只羊；对山谷型藏羊给予216 mg(J组)、240 mg(K组)、256 mg(L组)3个不同CAN FSH剂量，分别处理19只、15只、15只羊。

各试验组采用的超数排卵处理方法是第0天放CIDR栓，第9天开始注射FSH，间隔12小时注射FSH一次，FSH注射量递减，第5次注射FSH时注射PG 0.2 mg，第7次注射FSH时撤掉CIDR栓；同时在放CIDR和配种时各注射维生素ADE注射液3mL，撤栓时用0.9%生理盐水冲洗阴道，配种时注射促排3号15 μg。超数排卵处理方案见表1。

1.4 供体羊配种

撤栓后12 h开始试情，第1次站立发情12 h后配种，之后间隔10～12 h再配一次，连续配种2～3次。

表1 超数排卵处理方案Table 1 Superovulation treatment scheme

1.5 胚胎的采集与质量鉴定

以发情之日为0 d，第7 d采用手术法回收胚胎。用含1%血清的杜氏磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗两侧子宫角,每侧用液20～30 mL。子宫回流液静置3～5 min后在实体显微镜下捡出卵子,并保存在保存液中。根据形态学标准进行胚胎分级，通常说的有用胚胎或可移胚胎包括A、B、C级胚胎,由于保种需要，本文中有效胚胎为A、B级胚胎。分级标准详见《NY/T 1674 牛羊胚胎质量检测技术规程》。

1.6 数据处理

采用SPSS 17.0软件试验数据进行统计分析，试验数据以“平均值±标准差”表示，采用单因素方差分析对各组数据进行差异显著性分析。P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。超数排卵有效但冲卵失败的个体不计入个体数。

2 结果与分析

2.1 青海藏羊超数排卵效果

超数排卵处理220只次高原型青海藏羊，结果为只均黄体数6.89个，只均获卵数4.93 枚，只均获有效胚3.34 枚。

2.2 高原型不同CAN FSH剂量超排效果的比较

由表2可见，A组卵子回收率、有效胚率、受精率高于B组(P>0.05)，黄体数、回收卵数、有效胚数低于B组(P>0.05)。C组黄体数高于B组(P>0.05)，回收卵数、卵子回收率、有效胚数、有效胚率低于B组(P>0.05)，受精率显著低于B组(P<0.05)。

2.3 高原型不同JP FSH剂量超排效果比较

由表3知，E组黄体数、回收胚数、胚胎回收率、有效胚数高于D组(P>0.05)，有效胚率、受精率低于D组(P>0.05)。F组黄体数、回收卵数、卵子回收率高于E组(P>0.05)，只均有效胚数、有效胚率显著低于E组(P<0.05)，受精率也低于E组(P>0.05)。

表2 高原型不同CAN FSH剂量超数排卵效果的比较Table 2 Comparison of ovulation effect of FSH in high altitude type %

表3 高原型不同日本产FSH剂量超数排卵效果的比较Table 3 Comparison of ovulation effect in different Japanese FSH in high altitude type %

2.4 欧拉型不同CAN FSH剂量超排效果比较

由表4可知，G组受精率高于H组(P>0.05)，黄体数、回收卵数、卵子回收率低于H组(P>0.05)，有效胚数、有效胚率显著低于H组(P<0.05)。I组黄体数高于H组(P>0.05)，回收卵数、卵子回收率、有效胚数、有效胚率、受精率低于H组(P>0.05)。

2.5 山谷型不同CAN FSH剂量超排效果比较

由表5可见，J组黄体数、回收卵数、有效胚数、有效胚率、受精率都低于K组(P>0.05)，卵子回收率高于K组(P>0.05)。L组黄体数、回收卵数、卵子回收率高于K组(P>0.05)，均有效胚数、有效胚率、受精率低于K组(P>0.05)。

表5 山谷型不同CAN FSH剂量超数排卵效果的比较Table 5 Comparison of ovulation effect of FSH in different CAN FSH in valley type %

3 讨 论

3.1 青海藏羊超数排卵效果分析

此次试验青海藏羊只均获有效胚数明显低于进口品种，也低于张静芳等[4]、朱芳贤等[5]报道的地方品种，可能造成青海藏羊只均获有效胚低的原因，一是高寒、高海拔地区羊对激素的反应不好。二是藏羊繁殖率低，母羊一般年产一胎，一胎一羔，产双羔者很少。三是这些供体羊之前都是放牧，和人接触少，超数排卵处理过程中应激大，可能造成卵泡闭锁排卵少，以及胚胎退化，同时配种效果不好也降低了卵子受精率，最明显的影响是试情时躲闪，无法判断准确发情时间；以及配种时母羊不稳，造成公羊射精不充分，或是公羊精液没有射到母羊生殖道深部，流失过多。四是供体羊有的剽悍有的弱，群体中肥瘦分化大，剽悍者采食过多而过肥，弱者采食少而过瘦，肥瘦效果都不好。建议开展青海藏羊繁殖技术应用前训养一个月以上，注意羊和人的亲和训练，同时根据个体大小，采食能力分群饲养。同时加强营养，每天每只羊喂富含硒、锌、维生素A等矿物质、微量元素和维生素的精料200 g。

3.2 不同FSH剂量超数排卵效果的比较

此次试验表明，高原型适宜FSH剂量为JP 20.0 AU和CAN 240 mg；欧拉型适宜FSH剂量为CAN 256 mg；山谷型适宜FSH剂量为CAN 240 mg。适宜FSH剂量是取得好的超数排卵效果的关键因素之一。较大的剂量会造成较强的激素应答反应，刘广振[8]认为较强的激素应答反应使得部分个体优势卵泡排卵过早，黄体功能不全，分泌孕酮水平较低，从而造成胚胎退化，有效胚率低。谭景和等[6]、桑润滋等[7]、潘红梅等[81]、孙凤俊等[9]、朱芳贤等[11]认为较大的剂量会造成卵巢过度增大，卵泡过度增多，从而可能使卵母细胞质量下降，最终未受精卵多，受精率低。本研究中，较强的激素应答还造成卵巢过度增大及大量的黄体反应，卵巢与黄体表面积超过输卵管伞表面积，即伞包裹不住超排后的卵巢，排卵后卵子未进入输卵管中而直接掉入腹腔，最终卵子回收率低。试验结果验证了以上观点，试验中高原型、欧拉型、山谷型超数排卵中的280 mg、276 mg、256 mg等大剂量CAN FSH组，及高原型的24.0 AU大剂量JP FSH组都是卵泡发育多，但回收到的卵子少，回收率低，有效胚胎少，未受精卵多，受精率显著低。当然，超数排卵剂量也不能太偏低，偏低容易造成卵巢不启动，无法获得更多胚胎，试验中小剂量组有效胚胎少就说明这个问题。

4 小 结

本试验超数排卵处理220只青海藏羊，只均黄体数6.89个，获卵数4.93枚，有效胚3.34枚；高原型适宜FSH剂量为JP 20.0AU和CAN 240 mg；欧拉型适宜FSH剂量为CAN 256 mg；山谷型适宜FSH剂量为CAN 240 mg。