侯胜奎，陶晨雨，胡慧艳，刘 津，张 婧，贾 青,2,3*

(1.河北农业大学 动物科技学院，河北 保定 071000；2.国家北方山区农业工程技术研究中心，河北 保定 071000；3.河北省山区农业工程技术研究中心，河北 保定 071000)

20世纪90年代初，SRY基因被Sinclair等[1]首次在哺乳动物性腺中发现，研究者发现SRY基因位于性染色体Y短臂拟常染色质区，为单一外显子，长度为850 bp,为一性别决定基因。Koopman等[2]将含有SRY基因的DNA片段(14 kb)移植给XX染色体的雌鼠体内,在11只转基因XX小鼠中，有3只成功实现性反转成为雄性,通过这个试验揭示了动物性控的奥秘。目前,有关研究人员利用SRY基因对哺乳动物(猪、袋鼠、猩猩、猫、狒狒、马、羊、骆驼、犬、牛等)做了大量的性别鉴定试验[3-6],检测结果表明雄性动物全为阳性，雌性动物全为阴性，性别差异非常明了。因此，SRY基因已经成为性别鉴定及选择等方面应用较成熟的基因。

本试验的目的是对公牛性染色体特异基因设计引物，进行公、母牛的性别鉴定。试验选择雄性性别决定基因SRY，对其设计引物,对引物的灵敏度进行了检测；并对公、母各20头荷斯坦奶牛群体进行了DNA样品盲检。通过对所设计引物灵敏度的检测，判断是否能够满足性别鉴定的需要，为后续的胚胎性别鉴定做准备。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用中国黑白花奶牛血液样品由徐水县漕河镇某奶牛专业合作社提供。

1.2 主要试剂

牛血液DNA提取试剂盒、2×Es Taq MasterMix(Dye)、ddH2O、染料(GelStain)、琼脂糖(Agarose)、100 bp DNA Ladder,均购自北京全式金生物技术有限公司。特异引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成

1.3 DNA的提取

取300 μL加有抗凝剂的牛血液样品，在样品中加入10 μL RNase A去除样品中的RNA，加入20 μL 蛋白酶K，500 μL Binding Buffer 3 (BB3)于样品中，涡旋30秒充分把样品混匀，把混匀的样品封口放入水浴锅中55 ℃过夜消化，把消化完全的样品经过短暂离心，然后把全部溶液加入到离心柱中，12 000×g离心60秒，倒掉过柱的液体。加入500 μL CB3溶液(已加入无水乙醇)，离心机12 000 ×g离心30秒，弃出液体。然后加入500 μL WB3溶液(已加入无水乙醇)，12 000 ×g离心30秒，弃出液体(此步骤重复2次)。12 000 ×g离心120秒，把残留的WB3溶液彻底去除。把离心柱放入一个干净的1.5 mL的离心管中，加入100 μL预热的EB(提前60 ℃水浴锅预热)，室温静置120秒，10 000 ×g离心120秒，洗脱DNA(为得到高浓度的DNA可多次过柱)，收集到的DNA于-20 ℃保存备用。

1.4 引物的设计

从GenBank检索到牛SRY基因序列(AF148462)，采用Primer 5.0进行了引物设计，经过反复筛选确定了一对引物如下：上有引物F:5′-CCACGTCAAGCGACCCAT-3′下游引物R: 5′-AGAGCCACCTTTCGTCTTCG-3′ 退火温度为60 ℃，预期扩增片段大小为66 bp。

1.5 PCR体系的建立

体系(25 μL):PCR反应优化程序：预变性94 ℃，5 min；循环94 ℃，30 s；66 ℃,5 s；72 ℃，30 s；32个循环；延伸72 ℃，4 ℃保存(表1)。

1.6 PCR体系的应用

1.6.1SRY基因的PCR扩增 采用优化后的PCR反应体系对已提取的公牛DNA模板、母牛DNA模板进行PCR扩增，同时，设置阴性对照。利用1.5% 的琼脂糖凝胶对PCR产物电泳30 min进行检测。

1.6.2 引物灵敏度检测 用不同浓度的雄性DNA检测引物的灵敏度，把提取的公牛DNA模板分别稀释为125 ng/μL、25 ng/μL、5 ng/μL、1 ng/μL、0.2 ng/μL、40 pg/μL、8 pg/μL、1.6 pg/μL、0.32 pg/μL，当DNA模板浓度分别为125 ng/μL、25 ng/μL、5 ng/μL电泳条带的亮度几乎没有差异，经过筛选，选择1 ng/μL、0.2 ng/μL、40 pg/μL、8 pg/μL、1.6 pg/μL、0.32 pg/μL，使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物电泳30 min进行检测。

1.6.3 随机性别盲检 取公、母牛各20 头已提取DNA的血液样本，覆盖样品标记的公、母编号，采用SRY基因设计的特异性引物对40 个样本DNA进行PCR盲检，判定公、母牛性别的准确性。

2 结果与分析

2.1 牛SRY基因PCR琼脂糖电泳结果

分别取4 头公牛、1 头母牛DNA样本进行PCR，设置一个阴性对照，对PCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，1～4泳道为公牛DNA样本，目标带大小66 bp，电泳检测有带，证明为雄性；5泳道为母牛DNA样本，电泳检测证为雌性；6泳道为阴性对照，电泳结果无带，证明样品没有受到污染。

2.2 引物灵敏度检测

对公牛已经提取的DNA模板进行稀释，检测引物的灵敏度。1～6泳道稀释浓度分别为1 ng/μL、0.2 ng/μL、40 pg/μL、8 pg/μL、1.6 pg/μL、0.32 pg/μL，按照已经优化的PCR体系条件对引物灵敏度进行检测，结果显示浓度为0.32 pg/μL时电泳结果没有条带，引物最终灵敏度为1.6 pg/μL。

2.3 随机性别盲检结果

对已经提取DNA的公、母牛各20 头进行PCR产物琼脂糖凝胶电泳盲检，覆盖其标记的公、母编号，对琼脂糖凝胶泳道进行编号(图3)，电泳结果表明2,4,5,9,11,14,17,19,21,22,25,27,29,30,33,34,35,37,39,40泳道为公牛DNA模板；1,3,6,7,8,10,12,13,15,16,18,20,23,24,26,28,31,32,36,38泳道为母牛DNA模板；发现公、母各占20 头，完全和检测前采样标记的公、母编号对的上，检测准确率100%。

3 讨 论

3.1 选择SRY基因作为特异基因的目的

SRY基因作为雄性特异基因，特异性比较强，宋淑珍[7]用绵羊SRY基因设计的特异引物对绵羊的性别进行了鉴定，鉴定结果非常准确。本试验通过牛SRY基因设计的一对特异引物，利用PCR技术对奶牛的性别成功进行了鉴定，并进行了样品的盲检，性别鉴定准确度达100%，与上述对绵羊性别鉴定的实验结果一致。另外本试验还进行了引物灵敏度检测，结果显示引物灵敏度达1.6 pg/μL，比张伟等[8]在多重PCR扩增体系中的50 pg/μL和巢式PCR灵敏度5 pg/μL灵敏度都要灵敏。证明了本试验采用牛SRY特异基因设计引物和方法的有效可行。SRY基因作为Y染色体特异基因有着较强的特异性，是常用的性别鉴定基因，稳定性和准确性都比较高。但由于该基因为单拷贝，模板量低时很难达到较高的灵敏度[9]。

3.2 PCR扩增技术的用途

PCR扩增技术是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它可以把生物体外的特殊DNA进行复制。PCR技术在性别鉴定上的原理是找到一个雄性特异基因，对其设计特异引物，利用PCR对其进行扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，有扩增条带的为雄性，未有扩增条带的为雌性。PCR技术在性别鉴定上的应用，极大地提高了性别鉴定的准确性，与其他性别鉴定方法相比较，缩短了鉴定时间，降低了试验成本是一种常规实验室能够承担得起的技术[10]。由于PCR扩增技术极为灵敏，并且各种动物Y基因序列同源性很高，很容易受到外源DNA的污染，从而导致假阳性结果的出现[11]。本试验也采用PCR扩增技术扩增目的DNA样本和目的条带，对奶牛的性别进行鉴定分析。

3.3 性别鉴定在奶牛生产上的应用

性别鉴定不但能够帮助人类减少性遗传疾病的发生，而且可以挽救濒临灭亡的珍惜动物[12]。更重要的是可以使乳用动物多产母畜，肉用动物多产公畜，从而满足人们的需求[13]。性别鉴定可以提高奶牛性别鉴定的准确性， 从而为奶牛胚胎性别的鉴定提供技术支持，以期增加母奶牛的数量，进而增加奶牛数量和产奶量。如果性别鉴定能成熟应用于奶牛场，会在一定程度上提高牛场的规模和经济效益。相信随着科学的发展，奶牛早期胚胎鉴定的时间会缩短，鉴定的准确性和特异性会增高。席继锋等[14]进行特异性巢式PCR扩增SRY基因以鉴定奶牛早期胚胎的性别，结果表明这种方法的鉴定准确性较高。本试验利用PCR扩增技术能够找到满足性别鉴定需要的引物，提高胚胎鉴定的准确性，与前人的研究结论一致。

4 结 论

本研究设计的牛雄性特异基因SRY引物符合试验预期并且能够很好的满足性别鉴定的需要；用该引物进行奶牛性别鉴定的准确度为100%。