马美玉

摘要：为研究大曲中微生物的组成，分析产果胶酶的特征采取研究的方式，研究泸州老窖酿酒大曲中微生物的分离鉴定情况。运用两种霉菌测定酶活筛选出活力最高的霉菌。一直以来中国传统发酵技术的运用，广泛在调味品行业、酿酒行业，在饮食上有非常深厚的影响。白酒酿造的时候会以“大曲”为发酵剂进行发酵，大曲含有众多的微生物和酶。但是在目前人们对酶的认识还极度缺乏，因此对大曲中产果胶酶微生物的分离鉴定及其产酶活力评价研究有很重要的意义。

关键词：大曲;产果胶酶;微生物;分离鉴定;产酶活力

国内目前对大曲中的微生物以及所含有的酶系认识还需要加强，由于认识不够完善和系统，因此在微生物领域还需要加强研究来补充这个领域内的空白。只有做好研究之后才可以更好的利用大曲，运用大曲酿酒是国内的传统工艺，泸州老窖是典型白酒的代表，在国内有很重要的地位，由于发酵工艺和制作工序独特老道，因此此酒有独特的香气和口感，研究的时候从白酒中分离鉴定产果胶酶微生物进行系统合理的研究，整理出相关的笔记为微生物的运用奠定理论基础。

1 试验分析

1.1 分离微生物

语言稀释法和划线分离的方式从大曲中分离出20株微生物，细菌15株真菌5株分别做好标记，其中真菌中有三株为耐热均，分离之后的菌保存与80℃的试验内以防后续使用。

1.2 测定果胶酶

测定果胶酶酶活，运用DNS发测定上述菌株中的产果胶酶活力，以标准曲线换算酶活力单位后测得所有的酶都有产果胶酶的能力，其中有两株产酶能力高于其他株，分别为一株真菌、一株细菌。

1.3 高产果胶酶

通过对产果胶酶能力高的真菌、细菌分别运用ITS序列进行PCR扩增得出产物，产物在0.01（%）的琼脂糖凝胶电泳确认之后送Invitrogen公司进行测序得出结果，对比真菌和细菌的最终结果，最终得出细菌与鹑鸡肠球菌之间的相似度高达99%，真菌与湿热子囊菌之间的相似度为百分之百。

1.4 细菌产果胶酶

在不同的环境下，PH对酶的可解离基团解离状态会产生很大的影响直到影响酶的催化活性，因此测定酶的特定PH环境值，对酶的合理生产尤为关键。字试验中针对细菌的产生的产果胶酶进行PH环境值测定，最终的结果表示细菌可以适应对方PH值为3.0，属于酸性。除了PH之外温度的影响也很重要，测定了细菌的最适反應温度，测定出在50℃的时候酶活性最为活跃，低于50℃的时候酶活随着温度的升高而升高，50℃为巅峰值，超过之后酶活降低。但是在60～70℃之间酶活存在回升的情况。把处于不同PH环境下的缓冲液进行处理之后的产果胶酶放置在30℃的情况下保温1h，取样在一定的倍数下稀释后测定酶活，与没有处理的酶进行对照评价PH的稳定性。最终结果显示细菌具有良好的稳定性，在PH=3、5～11之间酶活力为40%[1]。

将产果胶酶放置在不同的温度水浴锅中保温1h之后取样，按照一定的倍数稀释后在合适的条件下测定酶活，与100%未处理过的酶液进行对照评估热稳定性。最终的结果显示在30℃～60℃之间热稳定性能良好，再这样的环境下保温1h后酶的剩余酶活力仍旧保持在50%以上。但是超过50℃之后酶活力明显下降，60℃的时候酶活力为20%。

2 讨论与分析

不同地方的工艺、地域条件等导致大曲中微生物群落的分布存在多样性，截止到现在为止已经有大量关于大曲中微生物群落分布的研究。目前关于大曲微生物的研究基本上都是利用组学分析研究，从泸州老窖中分离鉴定出的微生物报道很少，评估其产果胶酶的能力。其中分离出来最终具有产果胶酶的为细菌肠球菌为热子囊菌。这为微生物在酿酒行业中发挥作用奠定了很好的基础。

3 材料与方法

3.1 材料

大曲。

3.2 培养

细菌分离采用牛肉膏蛋白胶培养基置于37℃、50℃内培养1～2天，PH值为7.0～7.2，真菌分离采用SDAY培养基与30℃、50℃内培养2～3天，产酶能力检测采用产酶培养基在37℃——细菌、30℃——真菌内，150r/min摇床培养3～4天。

3.3 产果胶酶酶活性检测

分别将细菌备制、真菌备制在特定的环境内。酶活检测采用DNS检测法测定，采取绘制标准的曲线。稀释一定量的半乳糖醛酸后加入DNS试剂，沸水浴15分钟后冷却，采用酶标仪检测540nm测定吸光度。粗酶液酶活测定，放置果胶量为1%，PH环境3.5，果胶底物0.05mol/L内，在50℃内水浴保温10min。按照一定的试剂混合后，将冷却后的缓冲剂适当稀释在酶标仪下测光吸收值。最适pH值，测定不同PH处理时间的不同，考虑产果胶酶的残余酶活力，考察产果胶酶的稳定性。将粗酶液体稀释一定倍数之后与最适PH值在30℃、60℃的情况下合理反应，分别保存1h后取样与最适PH果胶底物在适合的温度下合理反应，与尚未进行处理的粗酶液100%进行对照，测量在不同时间、不同温度内果胶酶的残余酶活力考察产果胶酶的稳定程度[2]。

4 结语

大曲中有非常丰富的微生物，微生物群落可以产生多样且复杂的酶系，进行催化膨大之后产生发酵反应，最终酿制成酒。大曲中的酶根据催化的功能可以分为糖化酶、液化酶、酸性蛋白酶等等，果胶属于带负荷的酸性大分子且广泛存在与植物细胞壁中，成为重要的组成部分。本文运用试验的方式筛选出细菌与真菌，对其进行详细分析研究后探索其中微生物产果胶酶的酶学性质。证明了在未来的发展中有非常好的潜力。

参考文献：

[1]徐鹏，王大红，陈亚欣，等.一株大麻脱胶菌株的分离鉴定及其产果胶酶发酵培养基的优化[J].中国麻业科学，2019（3）：122129.

[2]王晓丹，罗小叶，邱树毅.茅台大曲中一株嗜热放线菌的分离筛选及特性研究[J].中国酿造，2018（4）：5156.