左 琴 王劲松 范 涛 朱婉月 刘秋菊 刘佐民

(中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，国家啮齿类实验动物种子中心，北京 100050)

随着现代基因工程技术的不断发展和完善，研发产生的遗传工程小鼠日渐增加，对于这些遗传资源的种质保存目前主要采用精子冷冻和胚胎冷冻技术。精子冷冻和胚胎冷冻技术已经成为资源保存的主要手段和方法，但是一些遗传工程小鼠尤其是疾病模型小鼠因自身的繁殖能力低下，或未成年就死亡，或因先天性无输卵管、子宫等而出现繁殖困难或断种等问题[1]。卵巢冷冻和卵巢异体原位移植技术就成为保存此类雌性遗传工程小鼠或珍惜动物生殖功能的有效手段,是种质资源保存方法的必要补充，同时在研究不孕症治疗模型方面也有着广阔的应用前景。

卵巢组织移植作为研究繁殖生理的重要工具，多数的卵巢生理研究是将卵巢组织移植到皮下、肾包膜下等不同部位研究和分析激素的产生和卵巢功能的重建，本研究采用将卵巢移植到同种不同受体的同一部位即原位移植方式，使得移植受体可以实现妊娠与生育，这对满足特定个体生育要求以及挽救濒危动物物种具有特殊意义，1940年Robertson[2]首次报道了小鼠卵巢原位移植，此后这项技术得到Jackson实验室的改进和应用。小鼠卵巢组织冷冻移植并得到后代首次由Parrot[3]在1960年报道，研究者们随后进行了卵巢慢速冷冻、玻璃化冷冻和快速冷冻的研究。

本实验选用DAP213快速冷冻法[4]冻存卵巢并在复苏后原位移植，采用两种背景品系小鼠进行异体原位移植并进行比较，通过比对可以更快确定遗传背景，更好地完善冷冻保种体系；通过比对幼鼠毛色，可以直观地辨别其目的基因，确认遗传背景，显著加快了基因型的检测工作，为小鼠种质资源保存奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

M2培养液(M7167-100ML, SIGMA)，M2培养液(M7292-100ML, SIGMA)，0.7%戊巴比妥钠溶液(P3761-5G, SIGMA)，0.9%生理盐水(石家庄四药有限公司)；0.25 mol/L蔗糖溶液、1 mol/L DMSO培养液和DAP213冷冻保护液(COSMO BIO CO.,LTD, JAPAN)。

CO2培养箱(8000DH, THERMO)；体式显微镜(SMZ645, NIKON)；冰箱(西门子KK21V1160 W)；维纳斯剪和脂肪镊等手术器械。

1.2 实验动物

本研究中使用C57BL/6 J、B6 albino(JAX000058)等品系均为SPF级小鼠，由国家啮齿类实验动物种子中心提供并饲养。10日龄体质量6～8 g的C57BL/6 J和遗传背景来源于C57BL/6 J的SCARB2、PSGL1、IGB3S遗传工程纯合雌鼠(本单位研发)为提供卵巢的供体鼠，4周龄13～15 g的C57BL/6 J和B6 albino雌鼠为受体鼠接受卵巢移植，B6 albino除了毛色基因与C57BL/6 J不一样外其他遗传背景相同，10周龄体质量26～28 g的C57BL/6 J成年雄鼠用于与卵巢移植复苏后受体鼠交配，在每个实验分组中均分别使用5只供体鼠及受体鼠。实验中共使用50只供体鼠和50只受体鼠，实验动物生产许可证号是SCXK(京)2014-0013；实验动物使用许可证号是SYXK(京)2016-0004。

本实验在中国食品药品检定研究院实验动物伦理委员会监督下进行，福利伦理审查证号是中检动(福)第2014(B)003号，所有实验在中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心进行。

1.3 供体鼠卵巢的取材

10日龄供体幼鼠颈椎脱臼处死，皮肤消毒，打开腹腔，暴露两侧子宫及卵巢，用脂肪夹固定卵巢脂肪，在解剖镜下用两把镊子撕开卵巢囊膜，暴露卵巢后用维纳斯剪剪断卵巢蒂底部连接处，将整个卵巢取出，放置到0 ℃冰盒上平衡的M2溶液中准备冻存或直接移植。

1.4 卵巢冷冻保存

采用DAP213方法冻存[4]，用微量加样器取100 μL的1 mol/L的DMSO溶液在60 mm培养皿上做4个液滴，将已经准备好的供体卵巢从M2溶液转移到DMSO液滴中平衡1 min，连续在DMSO溶液中转移平衡3次，最后一次平衡后将卵巢放入已在冰盒上内已有5 μL 1 mol/L的DMSO冻存管中，再次检查两侧卵巢是否均放入，完成后将冻存管放入冰盒平衡5 min，再将45 μL的DAP213冻存保护剂加入冻存管，拧上冻存管盖子，再次平衡5 min，然后快速将冻存管放入到液氮罐中的冻存架上。

1.5 冻存卵巢的复苏

采用文献方法复苏[4]，从液氮罐中取出冷冻保存3～6个月的冻存管，迅速拧开盖子，倒出管内液氮，立即计时30 s，用移液器取已经在37 ℃预热的0.25 mol/L蔗糖溶液900 μL，在计时器计时，到时将蔗糖溶液顺着距冻存管底部1 cm的管壁打入，并吸吹20次左右后将全部溶液连同卵巢吸出放到培养皿中，找到卵巢后，立即移入已经在37 ℃预热的100 μL的M16溶液液滴中，在液滴中平衡1 min，同样转移平衡10次后，将已经复苏回收的卵巢放入在冰盒上平衡的100 μL M2液滴中，准备移植待用。

1.6 受体卵巢移植

受体鼠用0.7%的戊巴比妥钠溶液麻醉，腹背部开口，摘除整个卵巢，再将新鲜或解冻复苏的四个品系遗传工程小鼠卵巢移植到C57BL/6 J和B6 albino受体鼠移出卵巢的原位中，将卵巢包膜覆盖住移植卵巢，随后将子宫和卵巢轻轻放回腹腔，缝合肌肉层和皮肤层。另外一侧卵巢用同样方法进行操作。手术后将受体鼠置于37 ℃恒温台保温，苏醒后送回饲养间。

1.7 移植后繁殖方式

将卵巢移植后受体鼠饲养到10周龄，与10周龄性成熟C57BL/6 J雄鼠1∶1长期交配，妊娠产仔后，观察和记录每胎产仔数及毛色。遗传工程小鼠剪尾进行基因检测。

1.8 统计方法

2 结果

2.1 C57BL/6 J新鲜和冻存卵巢原位移植到不同受体的比较

将10日龄C57BL/6 J雌鼠新鲜卵巢和冻存复苏卵巢原位移植到4周龄C57BL/6 J和B6 albino体内，表1结果显示，C57BL/6 J新鲜卵巢移植到C57BL/6 J妊娠率是80%，平均产仔数是(3.8±1.5)个；C57BL/6 J冻存卵巢移植妊娠率是80%，平均产仔数是(2.8±0.8)个,新鲜卵巢移植和冻存卵巢移植比较有显著性差异(P<0.05)。C57BL/6 J新鲜卵巢移植到B6 albino妊娠率是80%，平均产仔数是(4.0±1.0)个，毛色均为黑色；冻存卵巢移植妊娠率是100%，平均产仔数是(2.6±1.0)个，毛色均为黑色，受体是B6 albino，易从毛色就可以分辨出生小鼠来自于供体小鼠，新鲜卵巢移植和冻存卵巢移植比较有极显著性差异(P<0.01)。两种受体在冻存卵巢移植后的产仔数均低于新鲜卵巢产仔数。

表1 新鲜和冻存卵巢异体原位移植比较Table 1 Comparing the result of fresh and frozen/thawed ovarian heterotopically transplantion

2.2 遗传工程小鼠冻存卵巢原位移植到不同受体的比较

将10日龄纯合遗传工程小鼠SCARB2、PSGL1、IGB3S雌鼠冻存复苏卵巢原位移植到4周龄C57BL/6 J和B6 albino体内，表2结果显示，SCARB2品系冻存卵巢移植到C57BL/6 J妊娠率是100%，平均产仔数是(2.8±1.5)个；移植到B6 albino妊娠率是60%，平均产仔数是(3.3±1.2)个，毛色均为黑色,两种受体比较有显著性差异(P<0.05)。PSGL1品系冻存卵巢移植到C57BL/6 J妊娠率是80%，平均产仔数是(3.3±1.1)个；移植到B6 albino妊娠率是80%，平均产仔数是(2.8±1.1)个，毛色为黑色, 两种受体比较无显著性差异。IGB3S品系冻存卵巢移植到C57BL/6 J妊娠率是60%，平均产仔数是(2.7±0.5)个；移植到B6 albino妊娠率是80%，平均产仔数是(2.3±0.8)个，毛色为黑色，两种受体比较有显著性差异(P<0.05)。基因检测后均为杂合子。

表2 遗传工程小鼠冻存卵巢异体原位移植比较Table 2 Comparing the result of frozen/thawed genetically modified ovarian heterotopically transplantion

3 讨论

彭南妮等[5]总结了卵巢移植技术的进展，19世纪60年代开始进行卵巢移植技术的研究，并相继成功进行了小鼠、大鼠、兔、羊、猕猴和人的卵巢移植，开创了卵巢自体原位移植，自体异位移植，同种异体移植和异种移植等技术。本实验进行了小鼠的同种异体原位卵巢移植。Lara等[6]将受体动物双侧卵巢全切，体内缺乏性激素的条件下，发现植入异体的双侧卵巢发育良好，具有内分泌功能，并能与上级器官，即下丘脑垂体产生反馈应答，维持正常的动情周期，洪胜辉[7]将10月龄背景为C57BL/6 J小鼠的转基因小鼠新鲜卵巢取出，移植到8周龄C57BL/6 J体内，得到转基因小鼠的杂合后代，郁丽丽等[1]以10日龄、20日龄和4周龄鼠的卵巢为供体，移植到4周龄同品系的小鼠体内的结果显示，将卵巢异体移植受体后和正常的雄鼠交配，三组实验鼠均可怀孕产仔说明移植卵巢可以在受体内存活，并正常发育成熟和输卵管子宫建立互动关系。本实验将10日龄 C57BL/6 J小鼠新鲜和冻存卵巢移植到4周龄C57BL/6 J及B6 albino，恢复后和正常雄鼠交配，均妊娠产仔，与以上结论相符。

Parrot[3]将卵巢组织切片在12%甘油中平衡40 min再慢速冷冻到-79 ℃，原位移植后1/10的小鼠妊娠产仔。1997年，Gunasena等[8-9]发表了关于小鼠卵巢冷冻保存的两篇文章，报道了整个卵巢冻存后原位移植产仔，第一篇文章中是将冻存复苏后的卵巢移植给提供卵巢的同一只雌鼠，结果有63%的妊娠率，这个研究中存在一个问题，即是不能区分妊娠是由冻存复苏移植卵巢导致的或是之前的卵巢残余组织导致的妊娠，在第二篇文章中使用免疫缺陷小鼠作为受体，结果有25%的妊娠率。两次研究中的冻存方法都一样，用1.4 mol/L DMSO作为冻存液，在液氮蒸汽平衡后用程序降温仪慢速冷冻的方法。1998年Jorge等[10]采用慢速冷冻法冻存小鼠半个卵巢，在复苏移植后有57%的妊娠率。2004年朱孝荣等[11]用玻璃化冷冻液EFS40对Latsl基因敲除杂合子小鼠卵巢进行玻璃化冷冻，复苏后卵巢囊原位移植，移植后妊娠率为33.3%，平均产仔数为(3.7±2.2)只。本研究用在胚胎冷冻上已经取得极高成活率的DAP213冷冻保存液[4]，快速冷冻保存10日龄的C57BL/6 J小鼠及遗传工程小鼠卵巢，复苏及原位移植到C57BL/6 J和B6 albino品系后有60%以上的妊娠率，平均产仔数在(2.3±0.8)只以上，并且通过移植到除了毛色基因不一样，有相同遗传背景的B6 albino小鼠上，在妊娠产仔后很容易通过幼鼠的毛色辨别是否来自于C57BL/6 J的背景。卵巢移植面临的最大障碍是不同个体之间存在免疫排斥反应，要选择遗传背景相同的受体，但有时没有合适的相同背景的受体，进行卵巢的异种移植主要选用免疫缺陷动物作为移植受体如裸鼠、重症联合免疫缺陷鼠等[5]，所以下一步的研究将进行冻存卵巢的异种移植。