张玉玲，梁 艳，俞 钟，林传明，李海亮

(1.南康区第一人民医院肿瘤血液科；2.赣南医学院第一附属医院血液科，江西 赣州 341000)

白血病是一类起源于造血干细胞(hematopoietic progenitor cells，HPCs)和祖细胞的造血系统恶性增殖性疾病，其非实体瘤的特性决定了治疗方法以化学治疗为主，但大多数化疗药物有不同程度的造血系统毒性，且多数化疗药物在常规剂量内即可引起骨髓抑制。本研究运用流式细胞术(flow cytometry,FCM)动态监测成人AL患者发病时及化疗后外周血T淋巴细胞亚群、NK细胞，了解AL患者发病时免疫状态，了解AL患者随着化疗次数的增加免疫抑制是否加重。

1 材料与方法

1.1病例资料实验组为成人AL患者共47例，AML患者35例，ALL患者12例，年龄13～75岁，中位年龄43岁，诊断符合张之南《血液病诊断及疗效标准》。47例患者从初诊时开始跟踪数据、统计数据，但因为患者依从性不同，其中19例在初诊时进行了检测，19例患者在第1次化疗后进行了检测，17例患者在第2次化疗后进行了检测，21例患者在第3次化疗后进行了检测，13例患者在第4次化疗后进行了检测，10例患者在第五次化疗后进行了检测。所有AL患者不伴有其他肿瘤性疾病、免疫性疾病。对照组为22例医院健康体检者，无自身免疫性疾病、造血系统疾病、肿瘤性疾病，6个月内未使用过糖皮质激素等免疫抑制剂，男11例，女11例，年龄18～65岁，中位年龄42岁。

1.2实验器材与试剂

1.2.1实验试剂FACSTM红细胞裂解液，规格200 t，购自美国BD公司。

鼠抗人CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP、CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC标记荧光抗体，规格50 t，购自美国BD公司。

1.2.2实验仪器BD FACS Calibur型流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司。XN2000全自动血液分析仪购自日本Sysmex有限公司。

1.3标本采集及处理所有患者进MICM分型后，根据指南进行规范化疗。分别在AL患者发病时及化疗后2～3周空腹静脉抽取外周血5 mL，其中肝素抗凝2 mL，EDTA-K2抗凝3 mL，在2 h内送检。

1.4运用FCM检测T细胞亚群、NK细胞百分比取两支流式专用管，分别标记上1、2号，在1号试管中加入鼠抗人CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC荧光抗体8 μL，在2号试管中加入鼠抗人CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP荧光抗体8 μL，再各加入肝素抗凝全血60 μL，充分混匀，室温下避光孵育15 min；然后往两支试管中各加入红细胞裂解液600 μL，室温下避光孵育15 min，然后离心5 min，转速1 600 r·min-1；去除上清液，加入1.0 mL PBS，混匀后离心5 min，转速1 600 r·min-1；加 PBS 0.5 mL混匀后，采用BD FACSCaliburTMFlow Cytometer测定T细胞、NK细胞百分比。所有受检者标本都用同一阈值、补偿、电压等条件检测。两试管各收集淋巴细胞10 000个。

1.5T细胞亚群、NK细胞数量测定采用Sysmex XN2000血液分析仪计算成人AL患者和健康对照组外周血淋巴细胞数量，然后用所测的淋巴细胞数量乘以FCM所检测的T细胞亚群、NK细胞百分比。

2 结 果

2.1成人AL患者外周血NK、T细胞百分比比较表1显示，成人AL患者化疗后外周血NK细胞百分比有下降趋势，至第5次化疗后降至(12.67±7.49)%，组间NK细胞百分比比较差异有统计学意义(P=0.038)。成人AL患者初诊时、多次(第1至第5次)化疗后、未缓解时(指的是第1次化疗未缓解时且这部分患者之后不再归入实验组)，外周血NK细胞百分比相对于健康人群更低(P<0.05)。成人AL患者化疗后外周血T细胞百分比较初诊时上升，组间比较差异存在统计学意义(P<0.05)。成人AL患者初诊时、多次(第1至第5次)化疗后、健康对照组外周血NK细胞百分比均高于成人AL未缓解患者(P<0.05)。成人AL患者第2至第5次化疗后外周血T细胞百分比相对于健康对照组及初诊患者更低(P<0.05)(见表1)。T细胞百分比与化疗次数呈正相关(r=0.396，P<0.01)。

第6次化疗患者8例，化疗后AL患者NK、T细胞百分比分别为(17.20±5.72)%、(75.63±7.96)%。第7次化疗患者4例，化疗后AL患者NK、T细胞百分比分别为(11.87±2.38)%、(79.59±2.13)%。

表1 成人AL患者外周血NK、T细胞百分比比较

注：与健康对照组比较，*P<0.05；与NR组比较，

#P<0.05；与初诊时比较，△P<0.05。

2.2成人AL患者外周血NK、T细胞数量比较表2显示，成人AL患者第5次化疗后NK细胞的绝对数降为(0.11±0.04)×109·L-1。8组NK细胞的绝对数量之间有明显差异(P<0.05)。成人AL患者初诊时、化疗后、未缓解时的外周血NK细胞数量相对于对照组[(0.40±0.23)×109·L-1]更低(P<0.05)。8组T淋巴细胞绝对数量对比差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。NK细胞绝对数与化疗次数呈负相关(r=-0.29，P=0.004)。

第6次化疗患者8例，化疗后AL患者NK、T细胞数量分别为(0.16±0.09)×109·L-1、(0.71±0.28)×109·L-1。第7次化疗患者4例，化疗后AL患者NK、T细胞数量分别为(0.11±0.07)×109·L-1、(0.68±0.36)×109·L-1。

表2 成人AL患者外周血NK、T细胞数量比较

注：与健康对照组比较，*P<0.05。

2.3成人AL患者外周血T细胞亚群百分比比较表3显示，成人AL患者初诊时、化疗后、未缓解患者、对照组CD4+T细胞百分比、DNT细胞百分比、CD4+T细胞/CD8+T细胞比值无差异(P>0.05)。CD8+T细胞百分比与化疗次数呈正相关(r=0.259，P=0.01)。

成人AL患者初诊时、化疗后、未缓解患者的外周血CD8+T细胞百分比相对健康对照组外周血CD8+T细胞百分比[(23.36±6.87)%]更低(P=0.02)(见表3)。

成人AL患者初诊时、化疗后、未缓解患者的外周血DPT细胞百分比相对于健康对照组外周血DPT细胞百分比[(0.51±0.32)%]更低(P=0.009)(见表3)。

第6次化疗患者8例，化疗后AL患者CD4+T细胞、CD8+T细胞、DPT细胞、DNT细胞百分比分别为(34.70±4.39)%、(33.00±5.7)%、(1.02±0.57)%、(6.90±2.68)%。

第7次化疗患者4例，化疗后AL患者CD4+T细胞、CD8+T细胞、DPT细胞、DNT细胞百分比分别为(37.19±3.62)%、(33.98±4.24)%、(1.87±2.06)%、(7.46±2.28)%。

2.4成人AL患者外周血T细胞亚群数量比较成人AL患者初诊时、多次化疗(第1至第5次)后、未缓解的患者、对照组CD4+T细胞数量、CD8+T细胞数量、DPT细胞数量、DNT细胞数量比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表4)。

第6次化疗患者8例，化疗后AL患者CD4+T细胞、CD8+T细胞、DPT细胞、DNT细胞数量分别为(0.32±0.11)×109·L-1、(0.32±0.15)×109·L-1、(0.009 9±0.005 8)×109·L-1、(0.060±0.040)×109·L-1。第7次化疗患者4例，化疗后AL患者CD4+T细胞、CD8+T细胞、DPT细胞、DNT细胞数量分别为(0.31±0.16)×109·L-1、(0.30±0.17)×109·L-1、(0.010 0±0.004 6)×109·L-1、(0.065±0.404)×109·L-1。

表3 成人AL患者外周血T细胞亚群百分比比较

注：与健康对照组比较，*P<0.05。

表4 成人AL患者不同时期外周血T细胞亚群数量

3 讨 论

白血病既抑制正常造血，又影响免疫系统。免疫系统组成部分之一的淋巴细胞，在抗实体瘤、白血病过程当中承担关键性的角色。

NK细胞只出现在哺乳动物体内，约占人外周血单个核细胞的15%，其在宿主防御过程中起着非常重要的作用。我们研究发现成人AL患者初诊时的NK细胞百分比、数量均相对于健康人群更低，说明AL患者初诊时就存在NK细胞免疫缺陷，这与张司琪、孔令君、孙鸿丽等[1-3]研究结果一致。我们的实验表明化疗1～5次后，NK细胞百分比、数量仍低于健康对照组，提示杀死了大部分白血病细胞后，NK细胞水平仍未恢复正常，这可能是药物、白血病细胞的抑制作用、营养状态等多种因素导致，NK细胞何时恢复正常水平，需要延长观察时间进一步分析。实验还发现未缓解患者的NK细胞百分比、数量均低于健康人群，且百分比明显低于初诊患者及化疗后缓解患者，说明未缓解患者NK细胞免疫缺陷，且比初诊时更严重。

T细胞作为特异性免疫细胞在抗肿瘤免疫应答中起重要的作用，但在不少肿瘤患者中，T细胞功能异常、各亚群分布紊乱[4-6]。研究表明T细胞上的PD-1表达增加[7]。理论上白血病细胞负荷大时T细胞上PD-1与白血病细胞上的PD-L1结合导致细胞凋亡，T细胞数量减少。而本实验表明成人AL患者初诊时外周血T细胞百分比、数量与健康人群比较无差别，说明成人AL患者的T细胞在绝对数方面受影响不大，但不排除功能改变的可能，这结果与张司琪、孔令君、孙鸿丽等[1-3]研究结果不一致，这与本实验所选的健康对照组的T细胞百分比(64.98±10.68)%较低有关，张司琪、孔令君、孙鸿丽等研究的健康对照组T细胞百分比分别是(73.5±6.76)%、(72.91±7.88)%、(73.49±6.42)%。成人AL患者第2～5次化疗后T细胞百分比升高，高于初诊时，这结果与多个研究一致[1-3]，说明T细胞的抑制状态得到部分解除。

T细胞分化路径为：多能祖细胞或共同淋巴样祖细胞→双阴性T细胞(double negative T cell,DNT细胞)→双阳性T细胞(double positive T cell,DPT)→能识别外来抗原的T细胞(CD4+T细胞与CD8+T细胞)。CD8+T细胞并非均一的细胞群体，有很多亚群如CTL、CD8+Treg细胞。在癌症发生初期或者缓解期，机体的CTL可以杀伤少量肿瘤细胞，若癌细胞继续增殖至一定数量或癌症晚期，大多数患者已处于免疫抑制状态或者免疫紊乱状态，CTL的功能缺陷，则机体无法有效清除肿瘤细胞。本研究数据表明成人初诊、未缓解AL患者CD8+T细胞百分比均高于健康人群，与孔令君等[1]研究一致，说明初诊时、未缓解时CD8+T细胞处于激活状态，有利于抗白血病，但检测到CD8+T细胞绝对数量不增加，可能是因为其他细胞数减少如NK细胞致CD8+T细胞百分比增加。张司琪、孙鸿丽等研究发现初诊时、未缓解时CD8+T细胞与健康人群无差别，这与对照组的年龄、地区及所使用的流式仪型号有关[2-3,8-9]。

一般情况下，T细胞的发育过程是受紧密调节的，所以认为外周血DPT细胞是由于过早地从胸腺释放出来的。DPT细胞在不同疾病的外周组织中所起作用不一样，有时免疫抑制，如转移性结直肠癌DPT水平与TNF-α有关，可促进结直肠癌的生长和转移；有时表现为强效的细胞毒性作用，下调免疫系统对结直肠癌的杀伤[10-13]。DPT细胞在白血病的表达情况少有报道，本实验表明成人AL患者在初诊、化疗后、未缓解时DPT细胞百分比是升高的，其在白血病患者中所起作用是抑制还是细胞毒性作用，还需进一步研究，比如检测分泌的细胞因子。

DNT细胞是一群既不表达CD4分子，也不表达CD8分子的T细胞。在人体中， DNT细胞作为免疫调节细胞或细胞毒性T细胞参与免疫调节及免疫耐受。已有较多研究表明DNT细胞参与了免疫性疾病的发生及进展[14-16]。Merims等[17]研究表明DNT细胞具有很强的细胞毒性，能够杀伤自体的白血病细胞。丁荣[18]研究发现ALL儿童外周血DNT细胞水平低于健康人群。本文研究发现成人AL患者在初诊时、化疗后、未缓解时的DNT细胞百分比及数量与对照组比较无差别，这结果与丁荣不同，与两个研究的对象年龄段及AL类型不同有关。关于AL患者的DNT细胞变化研究甚少，无法明确DNT细胞在AL的作用，尚需进行分类型及功能的检测。

综上所述，NK细胞数量、T细胞百分比、CD8+T细胞百分比与化疗次数有关。但本次研究样本量较小、研究时间偏短，数据分析过程中相关偏倚不可避免，因此更大规模研究化疗对AL患者免疫状态影响，更有利于临床医生根据患者的免疫状态个体化地选择化疗次数及方案。