韩贤达 俞志刚* 吴 垚 江 欢,罗 芳 向阳可佳 周偲灿 罗亚兰

(1.无机特种功能材料重庆市重点实验室长江师范学院化学化工学院重庆涪陵 408100；2.哈尔滨理工大学化学与环境工程学院黑龙江哈尔滨 150040)

作为一种氨基糖苷类抗生素，卡那霉素(Kanamycin,Kan)常被用作兽药在畜牧业中使用[1]，因合成废液的不合理排放等因素，可导致河流、地下水，甚至生活饮用水中存在一定药物残留[2]。经常饮用Kan超标的水会对人体产生毒害作用，如肾损伤、过敏反应和耐药性等[3-5]。近年来，生活饮用水中抗生素超标事件时有发生，严重威胁到人们安全，因此，开发新型检测技术具有迫切性和必要性。

随着适配体筛选技术的快速发展，电化学适配体传感技术正成为新型检测技术的前沿研究热点之一[6-8]。相比于其他传统检测技术，电化学生物传感器构建和操作简单、检测成本低、易于微型化以及可实现在线监测等优点，是农兽药残留检测技术发展的重要方向之一[9-11]。目前，尽管Kan适配体传感器已得到一些研究，但大部分需要借助酶催化或纳米材料的扩增以提高其灵敏度，方法存在检测条件苛刻、不稳定和传感时间慢的共性缺点，难以实现应用化[12-15]。本文采用亚甲基蓝(MB)的DNA标记技术，以Kan适配体为分子识别探针，使用电化学交流伏安法(ACV)为信号输出手段，构建了一种无酶和无纳米材料修饰的传感方法，可以实现对生活饮用水中Kan残留的绿色化学检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

所有电化学检测均在CHI1040C型多通道恒电位仪(上海辰华仪器有限公司)上进行。测试采用三电极系统：以制备的电极为工作电极，Ag/AgCl (3.0 mol/L KCl)电极为参比电极，铂丝为对电极。交流伏安法电势范围：0～0.5 V，振幅:25 mV，频率范围：1～300 Hz；循环伏安法电势范围：0～0.5 V，扫描速率范围:0.01～100 V/s。

适配体探针(CSP-MB)：5′-MB-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGAGTCAC-(CH2)6-SH-3′购自生工生物工程(上海)股份有限公司。原始适配体为21个碱基序列：TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA[16]，增加GTCAC 5个碱基的目的是增大探针反应区域与钝化试剂间距以减小反应空间位阻。卡那霉素-A(Kan-A)、卡那霉素-B(Kan-B)、阿莫西林(AXL)、氨苄西林(ACL)、四环素(TCL)、左氧氟沙星(LFX)、磺胺甲基异恶唑(SMZ)，以及4-巯基-1-丁醇(C4-OH)、6-巯基-1-己醇(C6-OH)、9-巯基-1-壬醇(C9-OH)、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)均购自Sigma公司(美国)；实验所用其他试剂为分析纯。测试缓冲溶液和稀释溶液分别为10 mmol/L PBS和PBS-300(10 mmol/L PBS含300 mmol/L NaCl)。所用的溶液均用去离子水(≥18.2 MΩ·cm)配制。

生活饮用水采集自重庆市涪陵新区当地自来水系统，分为A(住宅区1)、B(住宅区2)、C(住宅区3)和D(住宅区4)四个地点收集。

1.2 传感器构建方法

金电极按文献方法[17]处理。传感器构建分为4步：第一步将1.0 μL CSP-MB(0.2 mmol/L)和1.0 μL TCEP(10 mmol/L)混匀，置于暗处放置1 h以彻底还原二硫键；第二步用PBS-300稀释至1.0 μmol/L后，取20 μL滴加到电极表面保持1 h；第三步用PBS-300冲洗电极，并用C6-OH(2 mmol/L)于暗处钝化电极12 h；第四步用PBS-300再次冲洗电极去除多余的C6-OH。

探针覆盖密度和MB电子传递速率常数按文献方法[18，19]计算。

1.3 实验方法

所用目标物溶液均为新鲜配制。条件优化实验采用单因素法进行；电流-浓度曲线以在10 mmol/L PBS中获得的电流值对系列Kan-A浓度作图得到，按线性确定线性范围，按信噪比(S/N)=3确定检测限；用于选择性、传感速度和再生循环性能考察的工作溶液均为50%自来水A(1∶1，自来水A/10 mmol/L PBS)，所用目标物浓度均为100.0 μmol/L；方法加标回收实验在50%自来水溶液中进行，以A体系配制标准系列溶液确定定量参数作为计算依据，以其他3个体系配制加标溶液，采用线性范围内低、中、高3个浓度加标点以考察方法的准确度和精密度。

信号增益率(Signal Enhancement%，SE%)：SE%= [(I-I0)/I0]×100。其中，I为体系加入目标物平衡后的电流信号值，I0为背景电流信号值。该参数作为传感性能的评价指标。

2 结果与讨论

2.1 传感信号转导机制

信号转导机制为电极表面适配体探针CSP-MB起到兼捕获和信号传输双重作用。加入Kan-A之前，CSP-MB以自然弹性摆动状态存在，MB远离电极表面，电子传递效率低，背景电流小；加入Kan-A后，Kan-A被CSP-MB捕获形成茎结状复合物[20]，该构型变化能有效驱动MB至电极表面，使电子传递效率增大，检测电流升高。图1为传感器构建与信号传导机制原理图。

图1 传感器构建与信号转导机制Fig.1 Schematic diagram showing the sensor fabrication and signal transduction mechanism

2.2 主要传感参数的优化

实验对影响传感性能的4个主要参数，即探针孵育浓度、钝化溶剂链长度、ACV频率和检测温度进行了优化。探针孵育浓度可有效调控电极表面的探针数量，这是影响传感性能的主要构建参数之一[21]。如图2(a)所示，随浓度由0.5 μmol/L变化至5.0 μmol/L，SE%先由176.3±3.8%增大至230.6±5.6%后，降低至97.3±15.6%，最大值对应浓度为0.8 μmol/L，确定为体系的最佳探针孵育浓度，该浓度时计算CSP-MB探针覆盖密度为1.22E+12±1.3E+11(分子/平方厘米)。钝化溶剂链长度是另一个影响传感性能的主要构建参数。如图2(b)所示，随着溶剂链长度由C4增大至C9SE%先由198.2±6.2%升至228.2±9.0%后，降低至126.2±7.8%，C6-OH的SE%最高，确定为最佳溶剂链长度。除以上两个构建参数外，实验还对传感性能产生较大影响的两个检测参数进行了优化。如图2(c)所示，随着交流伏安法的频率由1 Hz变化到300 HzSE%由45.5±2.6%增大到226.2±8.8%后，降低到29.6±8.6%，50 Hz时SE%最大，确定为最优频率。对于检测温度影响来说，如图2(d)所示，随着温度由10 ℃变化到45 ℃，SE%由155.5±4.8%上升到230.0±13.0%后，减小到214.6±12.2%，35 ℃时SE%达到最大值，确定其为最佳检测温度。

图2 CSP-MB浓度(a)、钝化溶剂链长度(b)、ACV频率(c)及检测温度(d)对SE%的影响Fig.2 Effect of CSP-MB concentration(a),passivation diluent-chain length(b),ACV frequency(c) and temperature(d) on SE%

图3 (a)加入2.0 mmol/L Kan-A前后的交流伏安图；(b)加入2.0 mmol/L Kan-A前后的循环伏安图Fig.3 (a) Alternate current voltammograms obtained before and after adding 2.0 mmol/L Kan-A;(b) Cyclic voltammograms obtained before and after adding 2.0 mmol/L Kan-A

2.3 传感器表征

实验采用交流伏安法和循环伏安法两种电化学伏安技术对传感器反应的发生进行确认与表征，见图3。对于ACV法来说，如图3(a)所示，加入Kan-A前，在～-0.26 V出现了330.0 nA的背景电流峰，依据出峰电势位置判断其为MB的还原电流峰[22]；加入Kan-A后，电流明显增大到 1105.2 nA，说明随着Kan-A的加入，CSP-MB与Kan-A发生了键合反应形成复合物的同时引发构型发生变化，带动MB至电极表面并激发电子传递效率的提高，驱动传感过程的发生。对于循环伏安法来说，如图3(b)所示，加入Kan-A前MB的氧化与还原峰电位之差(ΔE)为33.2 mV，加入Kan-A平衡后减小至4.0 mV，说明Kan-A的加入增强了电极表面的电化学活性，有效提高了电子传递效率，佐证了传感过程的发生。根据Laviron方程[18]计算得到反应前后电子传递速率常数(ks)分别为36.0±2.6 s-1和142.5±5.8 s-1。

2.4 传感器综合性能

2.4.1 灵敏度和选择性实验对传感体系在纯缓冲介质中的电流-浓度信号关系进行了考察，并确定检测限和线性范围。如图4(a)和4(b)所示，电流信号与Kan-A的浓度正相关，随Kan-A浓度的增大而升高，在3.0 mmol/L时达到饱和，同时确定体系检测限(S/N=3)为～33.0 nmol/L。另外，如图4(b)中插图所示，线性范围在0.2～1.0 mmol/L之间，线性方程为：y=136.42x+1370.3，相关系数R2为0.9726。

图4 (a)加入系列浓度Kan-A的交流伏安图；(b)电流-浓度信号曲线(内插图为线性范围)Fig.4 (a) Alternate current voltammograms after adding series concentrations of Kan-A;(b) Current-concentration curve(Inset:figure shows the linear regression line)

图5 7种抗生素分子的SE%Fig.5 SE% of 7 antibiotics

为评估选择性能，以Kan-A的同源结构物质Kan-B和其他5种抗生素AXL、TCL、ACL、LFX和SMZ为干扰物质，在以50% 自来水A为检测体系、抗生素浓度均为100 μmol/L和交流伏安法最佳频率50 Hz的实验条件下，通过得到的SE%值评估传感器的抗干扰能力。如图5所示，加入Kan-A和Kan-B的SE%分别为82.3±4.2%和70.8±3.6%，区分度不大。究其原因是两分子结构上相似度较高，仅为一个基团的差别，该结果与文献报道的所用适配体对两分子的解离常数(kd)相一致[16]。相比较看，其他5个抗生素的SE%均较小，说明传感器区分能力较高，显示出优良的选择性能。

2.4.2 传感速度和循环再生性除灵敏度和选择性外，实验还对传感速度和循环再生使用性能进行了考察。如图6所示，电流在15、30、45 s时分别达到饱和值的75.8%、92.4%和99.7%，仅需约45 s基本达到平衡，如此快的响应速度有利于建立快速的分析方法。传感器再生过程简单，以温热的去离子水(约为40 ℃)侧向冲洗电极表面约1 min后，在工作溶液中平衡约20 min即可实现。图7显示了传感器再生循环使用3次的SE%变化情况，每次使用后SE%为呈逐渐降低趋势，可能与单次传感后适配体探针发生降解或单分子膜有序性受损，增大了空间位阻进而降低传感效率有关，总下降率约为7%，传感器3次后使用仍保持较高的传感能力，表现出优良的重复使用性能。

2.5 方法学验证和实际样品分析

根据上述传感器的综合性能指标，以50%自来水A为标本溶液，对该方法在实际样品中的相关参数进行了验证，并作为计算依据对其他3个实际自来水体系进行了检测，相关参数及检测结果见表1。如表1所示，方法学验证参数中检测限为0.06 mmol/L，加标回收率在线性范围内高、中和低3个浓度点的平均值介于85.8%～94.3%之间，相对标准偏差(RSD)介于5.6%～11.2%之间。参照欧盟标准对农兽药残留方法加标回收率介于70%～130%之间，RSD≤20%，对牛奶中Kan的最大残留限量≤150 nmol/L(生活饮用水中抗生素残留限量标准目前还未出台)，该方法用于实际样品检测具有有效性。将该方法用于3个不同住宅区取水点样品的检测，结果均未检出Kan-A残留。

图6 电流-时间曲线Fig.6 Current-time curve

图7 再生循环曲线Fig.7 Regeneration-cycle curve

表1 实际自来水样品中方法学验证参数和检测结果一览表Table 1 Data sheet of methodological validation parameters and analytical results in real tap water samples

*LR=linear range;DL=detection limit;SC=spiked concentration;MR=mean recovery;RC=residual concentration;nd=not detected.

3 结论

本文以适配体探针为特异性分子识别元件，建立了生活饮用水中Kan残留的电化学传感新方法。所构建的传感器具有免样品前处理、操作简单、响应快速、无需添加外源试剂且可再生重复使用的特点，结合性能参数验证结果显示，其用于实际样品的分析具有有效性，预示该传感体系利于发展成快速、准确的应用型定量检测方法，并可用于借鉴到其他样品体系如牛奶和血清等的检测中。