赵锦锦， 徐晓勇， 朱勇俊， 陈志明， 范亚新， 胡佳丽， 毋海兰， 王 雨， 李 熠， 郭蓓宁， 张 菁

奈诺沙星是一种新型无氟喹诺酮类抗菌药物，作用于细菌DNA回旋酶和拓扑异构酶Ⅳ，通过抑制细菌复制起到杀菌作用[1]。该药具有广谱抗革兰阳性菌、革兰阴性菌和非典型病原菌的抗菌活性，尤其是多重耐药肺炎链球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌[2]。苹果酸奈诺沙星胶囊于2016年6月经国家药品监督管理局批准上市。该药具有口服吸收迅速完全、血药浓度高、体内分布广泛和生物利用度高等良好的药动学特点[3-4]，获批适应证为社区获得性肺炎。

临床前研究显示该药肺组织穿透性好，但目前国内外尚未见该药在人体支气管和肺组织中的穿透性研究报道，也未见该药在支气管和肺组织中浓度的检测方法。本研究旨在建立一种超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）法用于人体肺组织、支气管黏膜和支气管分泌液中奈诺沙星的药物浓度检测，并对该方法进行验证。因支气管黏膜和支气管分泌液量稀少，本研究尝试使用0.9% NaCl溶液替代，并通过替代基质准确度考察，验证替代基质的合理性。

检测方法建立后可应用于人体肺组织、支气管黏膜和支气管分泌液穿透性研究中的样品检测，以组织体液的药物浓度和血浆药物浓度的比值，评估奈诺沙星的肺组织、支气管黏膜和支气管分泌液的穿透性[5]。

1 材料与方法

1.1 仪器

Waters UPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司），API 4000-QTRAP质谱分析仪（美国AB SCIEX公司），Analyst数据处理软件（美国AB SCIEX公司，版本号1.6.2），XS 205电子分析天平（瑞士Mettler Todelo公司），Bertin Precellys 24生物样品均质器（法国Bertin Technology公司），B3510E-DTH超声波清洗机（美国Branson公司），Milli-Q®IQ 7000超纯水仪（密理博中国有限公司），Allegra®X-15R冷冻离心机（美国Beckman公司），MDF-U443低温冰箱（-40 ℃）（日本Panasonic公司）。

1.2 试剂

乙腈（HPLC级）、甲醇（HPLC级）、甲酸（分析纯）均为美国Sigma-Aldrich公司，超纯水（HPLC级，Millipore超纯水系统），0.9% NaCl溶液（医用级，上海百特医疗公司）。

1.3 药品

苹果酸奈诺沙星（纯度：72.2%，以奈诺沙星计；批号：E0），内标为苹果酸奈诺沙星-D3（纯度：72.39%，以奈诺沙星-D3计；同位素纯度：99.9%；批号：180604-1），均由浙江医药有限公司新昌制药厂提供。

1.4 色谱条件

色谱柱为ACE UltraCore 2.5 super C18（4.6 mm×50 mm，2.5 μm）；流动相：A相为0.3%甲酸水溶液，B 相为甲醇；流速：0.6 mL/ min；柱温：35 ℃；自动进样器设定温度：10 ℃；进样量：5.0 μL；洗针液：50%甲醇水溶液；分析时间：2.0 min；洗脱梯度：0～0.3 min，维持60% A；0.3～0.9 min，60%A降至30%A；0.9～1.5 min，维持30% A；1.5～1.8 min：30%A升至60%A；1.8～2.0 min，维持60% A。

1.5 质谱条件

电离源：电喷雾离子化（ESI）；检测模式：正离子多反应监测（MRM）；喷雾电压：4 500 V；加热气体温度：450 ℃；气帘气： 25 psi；Gas l（氮气）：45 psi；Gas 2（氮气）：55 psi。奈诺沙星选择离子通道为m/z372.5→m/ z354.5，奈诺沙星-D3为m/z375.5→m/z357.5。扫描时间均为200 ms。

1.6 空白肺组织、支气管黏膜和支气管分泌液样品来源及处理

取自1周内未服用过喹诺酮类药物且需行肺叶切除术的患者标本。肺组织剪碎后按每0.1 g加入0.9% NaCl溶液1.9 mL，以生物样品均质器粉碎（6 000 Hz，120 s）后离心（3 000 r/min， 10 min），取上清液制成空白肺组织样品溶液。支气管黏膜剪碎后按每0.01 g加90 μL 0.9% NaCl溶液，液氮反复冻融3次后超声30 min，浸泡24 h离心（3 000 r/min，10 min），取上清液制成空白支气管黏膜样品溶液。支气管分泌液按每0.1 g加400 μL 0.9% NaCl溶液，摇匀后超声30 min，制成空白支气管分泌液样品溶液。上述空白样品溶液均置于-40 ℃生物医药用冰箱待用。

1.7 标准曲线、质控样品内标和工作溶液配制

精密称量奈诺沙星标准品，加50%甲醇水溶液配制成1 000 mg/L标准曲线储备液，加入50%甲醇溶液稀释并配制浓度为0.400、0.800、2.00、5.00、10.0、40.0、100和200 mg/L的标准曲线工作溶液，再加入不同来源者空白肺组织样品溶液配制得含奈诺沙星浓度为0.020 0、0.040 0、0.100、0.250、0.500、2.00、5.00、10.0 mg/L的肺组织标准曲线样品。

精密称量奈诺沙星标准品加50%甲醇水溶液配制成1 000 mg/L质控储备液，加入50%甲醇水溶液稀释并配制浓度为1.20、10.0和150 mg/L的质控工作溶液，再加入不同来源者空白肺组织样品溶液配制成含奈诺沙星浓度为0.0600、0.500、7.50 mg/ L的样品，分别作为肺组织低浓度质量控制样品（LQC）、中浓度质量控制样品（MQC）、高浓度质量控制样品（HQC）。

同样的方法用0.9% NaCl溶液替代人空白支气管黏膜和支气管分泌液溶液来配置替代基质标准曲线和质控样品。

精密称取苹果酸奈诺沙星-D3（内标）标准品加50%甲醇水溶液配制成1 000 mg/L的内标储备液，用乙腈稀释配制成0.200 mg/L（以奈诺沙星-D3计）内标工作溶液。

上述溶液均分装后保存于-40 ℃医用冰箱。

1.8 生物样品的预处理

1.8.1 肺组织样品溶液预处理 样品测定当日，取50 μL空白肺组织样品溶液加入450 μL内标工作溶液（0.200 mg/L），涡漩混合5 min后12 000 r/ min离心10 min，移取200 μL上清液加入200 μL甲醇-0.1%甲酸水溶液（体积比1∶1），混匀后5 μL进样分析。

1.8.2 替代基质样品溶液预处理 样品测定当日，取20 μL空白替代基质样品（0.9% NaCl溶液）加入180 μL内标工作溶液（0.200 mg/L），涡漩混合5 min后12 000 r/min离心10 min，移取100 μL上清液加入100 μL甲醇-0.1%甲酸水溶液（体积比1∶1），混匀后5 μL进样分析。

1.9 标准曲线计算

根据奈诺沙星与奈诺沙星-D3的峰面积之比（y）和浓度（x）之间的关系，通过最小二乘法（权重：1/x2）求得标准曲线回归方程。以内标标准曲线法测定人肺组织、支气管黏膜和支气管分泌液样品中奈诺沙星的浓度。

1.10 方法学验证

采用各质控浓度的肺组织和替代基质质控样品考察方法的选择性、批内和批间的精密度和准确度、肺组织基质效应、替代基质准确度、提取回收率以及肺组织和替代基质质控样品在预处理前、后、室温放置不同时间，-40 ℃冻融3次和长期放置稳定性等，结果均符合药动学研究原则中有关生物样品分析的要求。

1.11 血浆和组织药物浓度的测定和穿透性评估

奈诺沙星肺组织、支气管黏膜和支气管分泌液穿透性研究，入选需行肺叶切除手术的患者，术前口服苹果酸奈诺沙星胶囊500 mg，每日1次，连续服药（4±1）d体内药物分布达到稳态，5例患者分别于末次服药后2 h、5 h、9 h、12 h或24 h留取血、肺组织、支气管黏膜和支气管分泌液样品。样品处理方法同1.6。采用上述经验证的检测方法测定患者肺组织、支气管黏膜和支气管分泌液中奈诺沙星的浓度。

患者的血浆样品的检测参考Guo等[6]报道的LC-MS/MS方法，并改用同位素内标进行改良。用肺组织、支气管黏膜和支气管分泌液中奈诺沙星浓度与同期血浆中的药物浓度比值来评估奈诺沙星的组织体液穿透性。本研究药物浓度数据均保

留3位有效数字。

2 结果

2.1 方法学验证

2.1.1 选择性 奈诺沙星和内标物峰形均良好，保留时间均约为0.82 min。奈诺沙星和内标的典型色谱图见图1、图2，可见各空白样品色谱峰对奈诺沙星对照品和内标峰形均无干扰，且分离良 好。

图 1 人空白肺组织、奈诺沙星0.020 0 mg/L 肺组织和服药患者肺组织样品中奈诺沙星和内标的色谱图Figure 1 Representative multiple reaction monitoring（ MRM） chromatograms for nemonoxacin and the internal standard in blank human lung tissue， lung tissue spiked with 0.020 0 mg/L nemonoxacin， and patient lung tissue

图 2 空白替代基质、奈诺沙星0.020 0 mg/L 替代基质和服药患者支气管黏膜及支气管分泌液样品中奈诺沙星和内标的色谱图Figure 2 Representative multiple reaction monitoring （MRM） chromatograms for nemonoxacin and the internal standard in blank surrogate matrix， surrogate matrix spiked with 0.020 0 mg/L nemonoxacin， patient bronchial mucosa and bronchial secretion

2.1.2 标准曲线及最低定量限（LLQQ） 在线性范围0.020 0～10.0 mg/L内，奈诺沙星肺组织、支气管黏膜和支气管分泌液浓度或浓度与峰面积比值间均呈良好线性关系，其中检测下限均为0.020 0 mg/L。研究中肺组织和替代基质标准曲线线性回归的决定系数R2范围分别为0.998 8～0.999 1和0.993 7～0.999 0。典型的标准曲线线性回归方程为肺组织y=0.330 8x+ 0.000 2，替代基质y= 0.213 5x-0.000 6。

2.1.3 精密度和准确度 分别配制奈诺沙星肺组织样品和替代基质的LLOQ以及质控样品（各5套），并在同一天内与随行的两套标准曲线样品经预处理后进样，计算批内精密度和准确度偏差。

结果显示奈诺沙星肺组织样品LLOQ和LQC、MQC、HQC批内和批间精密度分别≤3.5%和3.3%，准确度偏差分别≤4.5%和1.5%。替代基质样品LLOQ和LQC、MQC、HQC批内和批间精密度分别≤5.0%和6.0%、准确度偏差分别≤11.5%和6.0%。

2.1.4 基质效应 考察6个不同来源的空白肺组织样品对奈诺沙星和奈诺沙星-D3的质谱信号的影响。分别将浓度为0.060 0、0.500、7.50 mg/L的奈诺沙星溶液10 μL与内标基质效应考察溶液（奈诺沙星-D3，1.80 mg/L）10 μL混合，再加入180 μL空白基质（6个不同来源的空白肺组织）或甲醇-0.1%甲酸水溶液，涡漩混匀得到空白样品处理后含药溶液和单纯含药溶液。将上述两种溶液进样，按基质效应因子=空白样品处理后含药溶液峰面积/含药溶液峰面积的平均值，内标归一化的基质效应因子=待测物的基质效应因子/内标的基质效应因子×100%计算。

结果显示在LQC、MQC和HQC下，内标归一化基质效应因子分别为99.3%、98.0%和96.5%，变异系数均≤1.5%。

因支气管黏膜和支气管分泌液样品量过少，无法考察基质效应。

2.1.5 替代基质的准确度考察 配制奈诺沙星支气管黏膜、支气管分泌液样品溶液的质控样品（各3套），并在同一天内与随行的替代基质配制的两套标准曲线样品经预处理后进样，计算质控样品的精密度和准确度偏差，以评价替代基质能否准确测定真实基质中药物的浓度。

结果显示支气管黏膜和支气管分泌液各质控样品精密度分别≤1.7%和≤2.8%，准确度偏差分别≤10.0%和≤10.3%。见表1。表明使用0.9% NaCl溶液可替代支气管黏膜和分泌液基质，使用替代基质配制标准曲线和质控样品不会对检测的准确性产生影响。

表1 替代基质的准确度考察Table 1 Evaluation of accuracy of nemonoxacin measurement in surrogate matrix

2.1.6 提取回收率 用人混合空白肺组织样品溶液或替代基质配制的质控样品经预处理后进样（6份），同时参照2.1.4中空白组织样品处理后含药溶液的配制方法处理，将混合空白肺组织样品溶液和替代基质处理后含药溶液进样（6份），按提取回收率=质控样品处理后的面积/混合空白基质处理后加含药溶液面积×100%计算。

结果显示肺组织LQC、MQC、HQC的绝对回收率均值和变异系数分别为95.3%和2.67%、95.8%和1.76%、94.0%和1.03%。总体回收率和变异系数分别为95.0%和1.0%。内标提取回收率和变异系数分别为93.1%和3.3%。替代基质LQC、MQC、HQC的绝对回收率均值和变异系数分别为102.8%和3.35%、101.3%和1.9%、104.4%和1.41%。总体回收率和变异系数分别为102.8%和1.5%。内标提取回收率和变异系数分别为103.4%和2.3%。

2.1.7 稳定性考察 肺组织和替代基质样品预处理前室温放置26 h后、预处理后10 ℃放置48 h、冻融3次和-40 ℃条件下放置32 d后进样分析，回收率均在85.0%～115.0%，表明样品均稳定。

2.2 奈诺沙星在肺组织、支气管黏膜和支气管分泌液中穿透性结果

共入组需行肺叶切除术的肺癌患者5例，患者均在术前口服苹果酸奈诺沙星胶囊500 mg，每日1次，连用3～5 d达稳态后，分别在末次服药后不同时间于术中采集肺组织、支气管黏膜和支气管分泌液样品和同期血浆样品。患者口服奈诺沙星500 mg后2 h、5 h、9 h、12 h、24 h的肺组织、支气管黏膜和支气管分泌液中奈诺沙星药物浓度及与血浆浓度的比值见表2。

表2 行肺叶切除术患者肺组织、支气管黏膜和支气管分泌液中奈诺沙星浓度及其与血浆浓度的比值Table 2 Absolute and relative concentrations of nemonoxacin in lung tissue， bronchial mucosa， and bronchial secretion taken from patients undergoing lobectomy

3 讨论

本研究建立了采集和处理肺组织、支气管黏膜和支气管分泌液的方法。因肺组织血供丰富，采集患者肺组织时应选择远离肺门的远端肺组织，剪碎成小块后用0.9% NaCl溶液冲洗，再用无菌纱布挤干残留血，可减少血液对肺组织中药物浓度测定的影响。采集支气管黏膜时也易受血液污染，应在剥离支气管黏膜后立即用0.9% NaCl溶液冲洗[7]。

因空白支气管黏膜和支气管分泌液样品留取较为困难且量稀少，因此在方法学验证中以0.9% NaCl溶液作为替代基质代替空白支气管黏膜和支气管分泌液。对其进行了准确度考察，结果符合生物样品分析的要求，表明可以用0.9% NaCl溶液当作替代基质配制标准曲线及质控样品测定患者支气管黏膜和分泌液中奈诺沙星的浓度。

尚未见国内外奈诺沙星在肺组织、支气管黏膜和支气管分泌液中浓度检测方法的报道。本研究建立的肺组织、支气管黏膜和支气管分泌液UPLC-MS/MS检测方法，具有灵敏度高、样品分离良好、进样量小和分析时间短等特点。在本研究建立的色谱和质谱条件下，奈诺沙星肺组织药物的测定不受基质中内源性物质的干扰，替代基质的准确度考察也证实0.9% NaCl溶液可替代支气管黏膜和支气管分泌液准确测定真实基质中药物的浓度。方法学验证结果均符合药动学研究原则中有关生物样品分析的要求。因此，本研究建立的方法可为奈诺沙星组织穿透性研究中肺组织、支气管黏膜和支气管分泌液样品的检测提供可靠手段。

肺组织穿透性研究结果显示，患者口服奈诺沙星500 mg，每日1次，连续服药（4±1）d，体内药物分布达到稳态，肺组织、支气管黏膜和支气管分泌液浓度均高于血浆浓度，与血浆浓度之比分别为3.72～6.56、4.03～9.51、1.18～1.88。显示奈诺沙星在肺组织、支气管黏膜和支气管分泌液中穿透性良好，结合其针对社区获得性肺炎常见病原体杀菌效果好的特点，证明该药适于治疗社区获得性肺炎。因受试者例数较少，且个体间存在差异，需进一步扩大患者病例数，以获得该药更多肺组织、支气管黏膜和支气管分泌液穿透性数据。