钟益宁，柳 欢，吴诗云，张 焱，姚浩文，谭佩珍，刘华青，黄泽金

(1 广西中医药大学，广西 南宁 530299；2 防城港市万景林业有限公司，广西 防城港 538021)

牛大力为豆科崖豆藤属植物，美丽崖豆藤MillettiaspecisoaChamp.的根。具有补虚润肺，强筋活络等功效[1]。用于腰肌劳损，肺虚咳嗽等。主要分布在海南、福建、广西、广东等地，作为药食同源植物，广泛应用[2-3]。研究表明，牛大力根中含多种类型化合物，包括酚甙、黄酮类、紫檀烷类及多糖、氨基酸、生物碱等[4-5]。其有效成分、药理作用及多糖含量测定已有大量报道[5-6]，多糖测定方法主要有高效液相色谱法和比色法，前者因难以获得高纯度多糖对照品而较少使用，而比色法是测量多糖的常用方法，方法简单，应用广泛[6-7]。苯酚硫酸法是在硫酸催化下水解多糖，脱水生成糠醛及其衍生物，在490 nm处有最大显色吸收，且吸光值与糖溶液浓度呈正相关，可用于多糖测定。本文用苯酚硫酸比色法对处于生长期的牛大力多糖含量进行比较分析，评价牛大力的生长质量，为林下种植牛大力药材质量控制提供参考依据[8-9]。

1 实验样品与器材

苯酚、浓硫酸等均为分析纯；牛大力为防城港林下种植药材牛大力、巴戟天和黑老虎示范基地(2012年12月种植，分别于2015年2月、2017年10月及2019年2月三次采收)鲜牛大力，经广西中医药大学滕建北教授鉴定为美丽崖豆藤MillettiaspecisoaChamp.的根。

TU-1901紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；FA1104N电子分析天平，上海精科天平仪器厂；DHG-9023A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏试验设备有限公司。

2 方法与结果

2.1 牛大力多糖样品制备

(1)取三批优质新鲜牛大力1.0 kg，切片、磨碎，用95%乙醇回流脱脂2次，过滤，沉积物按料液比1:3(g/mL)加蒸馏水，煮沸浸提3次，每次1.0 h，合并、过滤、离心(5000 r/min，10 min)，收集上层液，减压浓缩到1/10体积，加95%乙醇，用密度计测定乙醇为80%左右，置于4 ℃冰箱过夜，过滤、离心(6000 r/min，20 min)，经冻干得粗多糖。将粗多糖用水溶解，小心滴加10%三氯乙酸去除蛋白，抽滤、离心(6000 r/min，20 min)，反复用乙醇、丙酮和乙醚交替洗涤，经冻干得精制白色多糖，见表1。结果表明，随着种植年限增加，牛大力多糖的含量增大，这可能由于糖类化合物在植物根部不断聚集相关，估计长成后多糖含量更高。

表1 鲜牛大力多糖含量

(2)取三批新鲜牛大力1.0 kg，切片，在烘箱80 ℃烘干，恒重称量，粉碎成粗粉；按(1)的方法提取纯化，得粗多糖和精制多糖，见表2。结果表明，药材干燥后，随着种植年限增加，干药材的质量也增加，剔除实验误差后，也显示药材质量与其种植的时间成正相关，植物越老，成数也越高。

表2 干燥牛大力多糖的含量

2.2 牛大力样品液制备

将三批鲜、干品精制多糖精确称取，蒸馏水定容至50 mL，摇匀得待测溶液，见表3。

表3 牛大力精制多糖取样量及浓度

2.3 最大吸收波长选择

参照文献[7]，用苯酚硫酸法时，在牛大力多糖与葡萄糖的最大吸收峰位490 nm处进行测定。

2.4 对照品样液制备

在105 ℃下烘箱中将对照品干燥至恒重，精密称量50 mg，置于500 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释，得0.1 mg/mL对照品液。

2.5 标准曲线制备

精密吸取0.1 mg/mL标准品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL分置于干燥具塞试管中，分别加水补至2.0 mL，精密加入5%苯酚1.0 mL，混匀，迅速加浓硫酸5.0 mL，混匀，静置10 min，然后置于40 ℃水浴中恒热15 min，取出后迅速冷至室温，以相应试剂为空白，在490 nm波长处进行测定，以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线(y=0.0412x+0.2816，R2=0.9993)。在2.0～16 μg/mL之间，葡萄糖浓度与吸光度呈良好线性关系，见图1。

图1 葡萄糖溶液标准曲线

2.6 精密度实验

取葡萄糖对照品及样品溶液， 按标准曲线制备项下方法，自“加入5%苯酚溶液1.0 mL”起，依法重复测定吸光度，连续测7次。对照品RSD为1.33；鲜品和干品的RSD分别为1.82和1.48(2015年批)； 2.36和1.79(2017年批)；1.66和2.13(2019年批)，结果表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性实验

取葡萄糖对照品及样品溶液，按标准曲线制备项下方法，自“加入5%苯酚溶液1.0 mL”起，同一样品在不同时间测吸光度，每间隔10 min 测一次，共6 次，计算浓度。对照品RSD为1.86；鲜品和干品RSD分别为1.74和1.53(2015年批)；1.90和1.59(2017年批)；1.68和1.89(2019年批)，结果表明：对照品和样品溶液在1 h 内稳定，说明该方法在一定时间内稳定性较好。

2.8 重复性实验

从三批次鲜品、干品牛大力精制多糖各精密称取5 份牛大力样品，按“2.2”项下的样品溶液制备方法制备样品液，按标准曲线制备项下的方法，自“加入5%苯酚溶液1.0 mL”起，依法重复测定吸光度，并计算其含量和RSD值，数据见表4，结果表明，苯酚硫酸测定法的重复性良好。

表4 重复性实验结果

2.9 加样回收率实验

精密吸取三批次鲜品、干品牛大力精制多糖6种样品液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL各三份，加入10.0 μg/mL的葡萄糖对照品1.0 mL，加水至总体积为2.0 mL，按测定标准曲线同样方法反应并测其吸光度值，数据见表5～表7，编号1、2、3为鲜品，4、5、6为干品牛大力精制多糖供试样品液。结果表明该方法具有较高的准确性和可靠性。

表5 2015年批加标回收试验结果

表6 2017年批加标回收试验结果

表7 2019年批加标回收试验结果

2.10 多糖含量比较分析

表8 牛大力多糖含量测定结果

分别取0.4、0.8、1.2 mL供试样液至10 mL 比色管中，加水至2.0 mL，另吸取蒸馏水2.0 mL 作空白对照，然后再加5%苯酚1.0 mL 及浓硫酸5.0 mL，静置10 min，摇匀，室温放置20 min 后，于波长490 nm处测定吸光度。按标准曲线计算浓度，取均值并按下式计算多糖含量：

多糖含量(%)=[(C×8)/V]÷1000×500÷50×100%

式中，C为标准曲线计算浓度，V是样品体积，结果见表8。

结果显示，多糖经脱色、去蛋白等操作后，多糖含量大幅提高。说明为了得到更准确的结果，需要进行除杂。数据还表明，不同的种植时间和采收季节，牛大力多糖含量不同，且随着种植年限增加，多糖含量增加，增幅较大，这可能与多糖在植物体内不断积聚有关。鲜品牛大力与干品有一定的差别，但不明显，干燥品容易粉碎，处理更方便一些。

结合前面的数据，多糖含量(mg/g)=精制多糖×多糖含量均值(%)÷药材量，经计算鲜品多糖分别为4.04、5.10、5.79 mg/g，干品多糖含量分别为4.37、5.35、6.27 mg/g。

3 结 论

因为多糖中含有脂、蛋白质、单糖等杂质，使实测值偏高，因此，进行脱脂处理很有必要，实验表明，经过脱脂、除蛋白等操作可以得到较纯的精制多糖。

实验表明，苯酚硫酸比色法能够准确地测定牛大力的多糖含量，三批牛大力鲜品的多糖含量均值分别为86.1%、87.7%、89.2%；干品为85.31%、86.4%、88.1%；鲜品多糖分别为4.04、5.10、5.79 mg/g，干品多糖含量分别为4.37、5.35、6.27 mg/g。

本文以苯酚硫酸比色法比较分析了处于生长期的牛大力多糖含量，采取脱脂和去蛋白操作进行改进，得到较为纯净的多糖，提高了准确性，为林下种植牛大力药材的质量控制提供理论分析依据。