（北京农业职业学院食品与生物工程系，北京 102442）

奶酒是蒙古族人的主要饮料之一，又称为“蒙古酒”，奶酒绵厚醇香，无色透明，少饮延年健体、活血补气，男女老幼皆可饮之[1]。但传统的奶酒酿制工艺繁杂，风味不稳定，为此，翁鸿珍等[2]对奶酒的工艺进行了优化，扈麟等[3]以鲜牛乳和糯米为主要原料研制出了一种新型奶酒。朱俊杰等以牛乳和核桃为主要原料，将核桃经粉碎、磨浆、脱脂、调配等工序处理后，用所得核桃粉以10%的体积分数加入新鲜牛乳中，接种乳酸菌和酵母菌为发酵剂，通过单因素试验和正交试验优化发酵工艺，最终酿出的核桃奶酒最佳工艺参数为乳酸菌和酵母菌的比例为1∶3，发酵温度30℃，发酵初始pH值4.5，发酵时间8d。在此条件下所得产品香味突出，口味独特。近年来，随着人们对健康饮食的关注度越来越高，富含酚类物质的葡萄受到广大消费者的喜爱。葡萄中的酚类物质主要包括黄酮醇、黄烷醇、酚酸和花色苷等，与葡萄的抗氧化活性相关[4]，并且有助于人体细胞和组织对抗自由基[5]，保护血管和血小板，平衡胆固醇[6]，调节血压、血脂[7]，提高抗氧化、抗炎症和抗内皮细胞功能障碍的能力。经常食用葡萄可以减小患心脏病、动脉粥样硬化、糖尿病和癌症等慢性病的几率[8]。此外，葡萄汁味美可口，营养价值较高，含有糖类、有机酸、矿物质、维生素、氨基酸、蛋白质、粗纤维、卵磷脂等[9]多种营养物质。本研究在前期奶酒研发的基础上，主要利用乳酸菌发酵剂和酿酒酵母的共同作用，以葡萄汁和鲜牛奶为原料，开发一款新型的低醇葡萄汁奶酒，为加快这一发酵乳制品的生产提供借鉴。

1 材料与设备

1．1 材料与试剂

牛奶、葡萄汁：市售；乳酸菌、酵母菌和曲霉菌菌种：食品安全检测中心保存；麦芽汁琼脂培养基、麦芽汁液体培养基、MRS琼脂培养基、MRS液体培养基等，购自北京陆桥技术股份有限公司。

1．2 实验设备

恒温培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂产品；超净工作台，上海锦屏仪器仪表有限公司产品；恒温摇床，江苏太仓市实验设备厂产品；氨基酸分析仪，上海辉世仪器设备有限公司产品；立式高压蒸汽灭菌锅， 上海博讯医疗生物仪器股份有限公司产品。

2 试验方法

2．1 工艺流程

2．2 操作要点

（1）原料处理：选用新鲜、无虫害、无霉烂变质的葡萄，清洗后榨汁过滤，贮于4℃冰箱备用。

（2）调配：纯牛奶、葡萄汁和白砂糖按一定比例进行调配。

（3）菌种的活化：将在甘油中保藏的乳酸菌、酵母菌和曲霉菌种，加入到对应的培养基中进行活化。然后离心去掉上清液后，用无菌水冲洗后离心去掉上清液，重复3次后备用。

（4）发酵：将经过预处理的葡萄汁牛奶分装在容量为500mL的瓶中，装液量为200mL，接入酵母菌、乳酸菌和曲霉菌，先进行单因素试验后再进行正交试验。接种后放入恒温培养箱内静置发酵。

2．3 单因素试验

2.3.1 葡萄汁奶酒的基础配方和工艺

接种量（酵母菌∶曲霉菌∶乳酸菌）为1.0%∶0.5%∶1.5%，蔗糖添加量为7%，葡萄汁添加量为6%，全脂牛奶的添加量为84%，发酵温度30℃，发酵时间为3d。

2.3.2 单因素的筛选

在基础配方和工艺的情况下，每次变化1个因素，而其他因素不变，通过感官评分的方式筛选出最优的因素水平。分别选取接菌比例（酵母菌∶曲霉菌∶乳酸菌）为①0.33%∶0.17%∶2.5%、②0.66%∶0.34%∶2.0%、③1.0%∶0.5%∶1.5%、④1.32%∶0.68%∶1.0%、⑤1.67%∶0.83%∶0.5%、⑥2%∶1%∶0%；发酵温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃；蔗糖添加量为3%、5%、7%、9%、11%、13%；发酵时间为1d、3d、5d、7d、9d、11d；葡萄汁添加量为1%、3%、6%、9%、12%、15%进行单因素发酵试验，并通过感官评分确定正交试验因子的水平。

2．4 正交试验

根据单因素试验的结果，对影响葡萄汁奶酒质量的5个因素：发酵温度（A）、发酵时间（B）、接种量（C）、蔗糖添加量（D）、葡萄汁添加量（E）进行5因子4水平正交试验，正交试验因子水平如表1所示。

表1 试验及因子水平

2．5 感官评价

感官评价在实验室内完成，邀请10名经过培训的人员组成评定小组，明确感官评价的指标和注意事项。感官评定的评分标准：根据成品的色泽（25分）、口感（30分）、香味（25分）、组织状态（20分）进行综合评分，满分100分。葡萄汁奶酒感官评分标准如表2所示。

表2 葡萄汁奶酒感官评价细则

2．6 理化指标的检测

2.6.1 总糖的测定

总糖（以葡萄糖计）的测定采用斐林试剂法[10]。

2.6.2 酒精体积分数的测定

酒精体积分数的测定采用密度瓶法[10]。

2.6.3 总酸的测定

总酸的测定采用电位滴定法[10]。

2.6.4 氨基酸态氮的测定

奶酒中氨基酸态氮的测定参考《GB/T 5009.39-2003，中华人民共和国国家标准 酿造酱油》进行测定[11]。

2．7 氨基酸成分的检测

奶酒中氨基酸成分的检测参考《GB 5009.124-2016 食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》[12]测定。

2．8 奶酒贮藏期间品质的评价

2.8.1 菌落总数的测定

奶酒贮藏期间菌落总数的测定根据《GB 4789.2-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[13]的方法进行检测。

2.8.2 感官评价

奶酒贮藏期间感官评价依照2.5的方法进行。

3 结果与分析

3．1 单因素试验感官评价结果

3.1.1 接种量对葡萄汁奶酒感官评价的影响

图1 接种量对葡萄汁奶酒感官评分的影响

由图1可以看出，随着酵母菌和霉菌接种比例的不断增加，葡萄汁奶酒的感官评分也随之不断增加。当接种比例为1.0%∶0.5%∶1.5%时，感官评分达到最高分，并显著高于其他各组（P＜0.05）。酵母菌在发酵过程中将可发酵性糖转化为二氧化碳和乙醇，同时还会产生其他一些醇、醛、酸、酯等香味物质[14]。当酵母菌和霉菌接种量偏低时，容易使得酿酒原料不能完全发酵，造成葡萄汁奶酒酒精度偏低，酒香不突出等。但如果乳酸菌的接种量较低时，特有的酸味又减弱了，感官评分也不高。因此，选择编号为2、3、4、5的接种比例进行正交试验。

3.1.2 发酵温度对葡萄汁奶酒感官评价的影响

由图2可以看出，随着发酵温度的提高，葡萄汁奶酒的感官评分也随之不断提高，当发酵温度达到30℃时感官评分达到峰值，但与发酵温度为25℃时的感官评分差异不显著（P＞0.05），然后开始下降。显然高温不利于酵母菌和霉菌的生长繁殖。因此，选择发酵温度为20、25、30、35℃进行正交试验。

图2 发酵温度对葡萄汁奶酒感官评分的影响

3.1.3 发酵时间对葡萄汁奶酒感官评价的影响

由图3可以看出，葡萄汁奶酒的感官评分随着发酵时间的延长而增加，当发酵时间为5d时，感官评分达到最高，并显著高于其他各个发酵时间（P＜0.05）。

图3 发酵时间对葡萄汁奶酒感官评分的影响

3.1.4 蔗糖添加量对葡萄汁奶酒感官评价的影响

由图4可以看出，葡萄汁奶酒的感官评分随着蔗糖添加量的增加而增加，当蔗糖添加量为9%时最高，与7%的添加量差异不显著（P＞0.05），但显著高于其他各个发酵时间（P＜0.05）。随着蔗糖添加量的继续增加，感官评分开始呈现逐渐下降的趋势，可能是由于过多的糖会被发酵菌株转化为酸类、酯类和醛类等物质导致的[15]。

图4 蔗糖添加量对葡萄汁奶酒感官评分的影响

3.1.5 葡萄汁添加量对葡萄汁奶酒感官评价的影响

由图5可以看出，葡萄汁奶酒的感官评分随着葡萄汁添加量的增加而增加，当添加量为9%时最高，并显著高于其他各个发酵时间（P＜0.05）。

图5 葡萄汁添加量对葡萄汁奶酒感官评分的影响

3．2 正交试验感官评价结果

表3 正交试验设计及结果

根据正交试验组合试验设计原理，通过SPSS 20.0软件设计正交试验，对接种量、发酵时间、发酵温度、蔗糖添加量和葡萄汁添加量5个因素分析得到以下试验方案及结果（表3）：5个因素对葡萄汁奶酒感官评分影响的强弱顺序依次为：发酵温度＞接种量＞发酵时间＞蔗糖添加量＞葡萄汁添加量。通过计算发现A2B2C2D2E4组合最佳，即发酵温度为25℃，发酵时间为5d，接种量为1.00%∶0.50%∶1.50%，蔗糖添加量为8%，葡萄汁添加量为11%。因为该组合不在正交试验序列里，因此进行了验证试验，结果表明该组合酿制的葡萄汁奶酒感官评分评分最高，为92分。

3．3 理化指标分析结果

经测得，葡萄汁奶酒在最佳发酵工艺条件下的总糖为9.5g/L，酒精体积分数为6.8%，总酸质量浓度为7.2g/L，氨基酸态氮质量浓度为0.21g/L，4种理化指标均符合GB/T 2354-2009的标准。

3．4 氨基酸数据分析结果

由图6可以看出，通过比较葡萄汁奶酒、奶酒和牛奶的氨基酸含量可以发现，葡萄汁奶酒中的天门冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸含量显著高于奶酒和牛奶中的含量（P＜0.05），但是苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和精氨酸的含量与奶酒和牛奶的含量差异不显著（P＞0.05）。

图6 发酵前后氨基酸含量的比较

3．5 葡萄汁奶酒贮藏品质变化

如表4所示，葡萄汁奶酒在贮藏期间的菌落总数随着贮藏时间的延长而增加，达到6个月时已经超过GB/T 2354-2009中的相关规定。感官评分则随着贮藏时间的延长而不断下降。因此，在现有条件下，葡萄汁奶酒的保质期不能超过6个月。

表4 葡萄汁奶酒在常温保存中的菌落总数和感官评分变化

4 结论

影响葡萄汁奶酒感官评分因素的强弱顺序依次为：发酵温度＞接种量＞发酵时间＞蔗糖添加量＞葡萄汁添加量，通过计算发现A2B2C2D2E4组合最佳，即发酵温度为25℃，发酵时间为5d，接种量为1.00%∶0.50%∶1.50%，蔗糖添加量为8%，葡萄汁添加量为11%。该组合酿制的葡萄汁奶酒感官评分最高，为92分。经测得，葡萄汁奶酒在最佳发酵工艺条件下的总糖为9.5g/L，酒精体积分数为6.8%，总酸质量浓度为7.2g/L，氨基酸态氮质量浓度为0.21g/L，4种理化指标均符合GB/T 2354-2009的标准。该葡萄汁奶酒中的天门冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸含量显著高于奶酒和牛奶中的含量（p＜0.05）。在现有条件下，该葡萄汁奶酒的保质期不超过6个月。