孙春霞 李瑞琴 苏丹华 闫五玲 李珊珊 吕凌燕 李志刚

近年来，肺癌发病率和致死率始终高居国内恶性肿瘤之首，组织学类型以非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)最为常见，根据NSCLC组织起源又可分为腺癌和鳞状细胞癌，前者更为多见，通常起病隐匿、侵袭性强[1]。近年来，人们的健康体检意识、临床相关诊断、治疗技术均较以往取得了长足进步，越来越多的肺癌患者能够在疾病早期得到明确诊断，并能够获得较为理想的治疗[2]。但一直以来，由于肺腺癌生物学特性复杂、复发转移率高，即使手术切除后长期生存率仍较低[3]。因此，进一步研究相关因子及分子机制有助于早期监测肺腺癌的发生、复发、转移及预测预后。叉头蛋白转录因子M1(forkhead box M1，FoxM1)是叉头蛋白家族中的重要成员，与细胞增殖、转移相关，且仅在增殖细胞中表达，目前已证实在乳腺癌[4]、贲门癌[5]、肝癌[6]等肿瘤组织中呈高表达，但在肺腺癌组织中的表达情况尚不完全明确。同时，环氧合酶2(cyclo-oxygenase-2，COX-2)蛋白的致癌性已得到广泛证实，已有实验证实其与肺癌的发生、发展密切相关[7]，但其促进肺腺癌进展的具体机制仍在进一步探究中，且其是否与FoxM1存在协同作用也未明确。基于此，现通过免疫组织化学法检测FoxM1和COX-2在肺腺癌组织及癌旁组织中的表达情况，明确二者的相关性，并探究其与临床病理特征、预后的关系。

资料与方法

一、临床标本

研究标本来源于我院病理科2015年1月～5月的存档蜡块，包括60份肺腺癌组织和35份癌旁正常肺组织(距癌组织>5cm)，通过细胞学检验查实和病理证实为肺腺癌，癌旁组织经HE染色证实无癌细胞浸润，取得病理结果前未接受手术、放化疗及其他抗肿瘤治疗，临床资料详实，能够定期取得电话或微信随访，以确诊之日为随访开始时间，终止事件为因肿瘤而死亡，已排除非肿瘤相关死亡。肺腺癌组织对应患者中，男41例，女19例；年龄48～80(57.27±9.55)岁；有吸烟史者42例；癌变位置：左肺36例，右肺24例；TNM病理分期：Ⅰ期14例、Ⅱ期20例、Ⅲ期19例、Ⅳ期7例；有淋巴结转移17例。

二、主要试剂与仪器

鼠抗人FOXM1单克隆抗体购自英国Abcam公司，兔抗人COX-2单克隆抗体购自美国Santa cruz公司，SP-9001二抗试剂盒、DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；DH4000A型电热恒温培养箱产自天津市泰斯特仪器有限公司，恒温冰箱产自青岛海尔公司，LH50A型倒置相差显微镜产自日本OLYMPUS公司，免疫组织化学孵育盒与免疫组织化学抗原修复盒，产自福州迈新生物技术开发有限公司。

三、方法

以标准化亲和素-生物素-过氧化物酶免疫组织化学法检测FoxM1和COX-2在肺腺癌组织及癌旁组织中的表达。肺腺癌组织、癌旁组织经福尔马林固定后石蜡包埋，连续切片，厚度4μm；操作步骤严格按照说明书进行，水化及抗原修复后，以3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶；分别使用单克隆抗体FoxM1(1 ∶400稀释)、COX-2(1 ∶200稀释)作为一抗 4℃孵育过夜，二抗与SP复合物各孵育30 min，均以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照；之后依次完成DAB染色、苏木精复染、乙醇脱水及中性树脂封片操作。结果根据阳性细胞率得分、染色强度判定，其中阳性细胞率=阳性细胞数/观察细胞数×100%，阳性细胞率<10%、11%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分别记0分、1分、2分、3分、4分；染色强度：黄色、棕黄色、棕褐色分别记1分、2分、3分；将阳性细胞率得分、染色强度得分相乘，参考文献[8]以最终得分>2分视为阳性结果。所有切片均由两名资深病理医师采用盲法(阅片时不知对应患者临床资料)独立评估。

四、统计学方法

研究数据以SPSS19.0统计学软件分析和处理，计数资料采取率(%)描述，癌组织、癌旁组织中FoxM1、COX-2表达对比进行χ2检验，二者的关系采用Spearman等级相关性分析，并借助χ2检验分析FoxM1、COX-2表达与肺腺癌病理特征的关系；通过Kaplan-Meier法(log-rank检验)分析生存情况，并以COX回归模型分析预后的影响因素；以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、FoxM1、COX-2表达情况

免疫组织化学显示FoxM1阳性主要表达于细胞核，COX-2阳性主要表达于细胞膜或细胞质；FoxM1、COX-2在肺腺癌组织中阳性表达率分别为58.33%、68.33%，均明显高于癌旁组织的17.14%、28.57%(P<0.05)。Spearman等级相关分析示，肺腺癌组织中FoxM1与COX-2表达无明显相关性(r=0.141，P=0.359)(见图1、2，表1)。

图1 FoxM1在肺腺癌组织及癌旁组织中的表达(×200)

注：A、B分别为FoxM1在肺腺癌组织中的阳性表达、癌旁组织中的阴性表达。

图2 COX-2在肺腺癌组织及癌旁组织中的表达(×200)

注：A、B分别为COX-2在肺腺癌组织中的阳性表达、癌旁组织中的阴性表达。

表1 肺腺癌组织及癌旁组织中FoxM1、COX-2表达情况比较[n(%)]

二、FoxM1、COX-2表达与肺腺癌各临床病理特征的关系

60份肺腺癌组织标本对应患者中，性别、年龄、癌变位置、肿瘤直径以及是否吸烟与FoxM1、COX-2表达均无明显相关性(P>0.05)；而Ⅲ～Ⅳ期肺腺癌组织中FoxM1、COX-2阳性表达率明显高于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴结转移者FoxM1、COX-2阳性表达率显著高于无淋巴结转移者(P<0.05)，即FoxM1、COX-2表达与TNM分期、淋巴结转移有关(见表2)。

表2 FoxM1、COX-2表达与肺腺癌各临床病理特征的关系[n(%)]

三、FoxM1、COX-2表达与肺腺癌预后的关系

截至2019年4月30日，所有肺腺癌患者随访至少48个月，23例死亡，死亡率38.33%。Kaplan-Meier生存分析显示，FoxM1阳性、阴性表达者中位生存期、生存率分别为16.6个月、31.4个月，48.57%、80.00%，有统计学差异(log-rankχ2=6.094，P=0.014)；COX-2阳性、阴性表达者中位生存期、生存率分别为21.2个月、35.0个月，43.24%、84.21%，亦有统计学差异(log-rankχ2=5.978，P=0.013)。以性别、年龄、吸烟史、癌变位置、肿瘤直径、TNM分期、有无淋巴结转移及FoxM1、COX-2表达情况为自变量，以生存时间为因变量，采用COX比例风险回归模型分析，结果显示，TNM分期(HR=4.118，95%CI：3.160～9.855)，淋巴结转移(HR=1.956，95%CI：1.148～3.394)及FoxM1阳性(HR=2.063，95%CI：1.335～4.251)、COX-2阳性(HR=1.467，95%CI：1.008～3.574)是肺腺癌预后的影响因素(P<0.05)(见图3、4，表3)。

图3 FoxM1阳性、阴性表达者的生存曲线

图4 COX-2阳性、阴性表达者的生存曲线

表3 多因素COX回归模型分析

讨 论

FoxM1与其他叉头蛋白家族成员不同，其主要通过对细胞周期进行调控来刺激细胞增生与有丝分裂进行，故与细胞增殖、代谢、凋亡有关，且仅在正在增殖的细胞中表达，而在细胞终末分化阶段消失，在胚胎发育、组织再生过程中FoxM1起着不可替代的作用[9]。近年来其在DNA损伤、肿瘤形成和进展等多种生理过程中的重要作用逐渐引起了临床学者的关注。既往研究[10]显示，FoxM1能促进肿瘤细胞发生上皮-间质转化，促使基质金属蛋白酶表达及血管上皮生长因子表达上调，从而增强肿瘤细胞迁移、浸润能力，促进血管形成及淋巴结转移。本研究发现FoxM1在肺腺癌组织中阳性表达率均明显高于癌旁组织，且与肺腺癌患者性别、年龄、癌变位置、肿瘤直径及是否吸烟无关，与TNM分期、淋巴结转移有关，表明肺腺癌组织中FoxM1表达增高，且与肿瘤进展、淋巴结转移密切相关。李冰等[11]的报道中，FoxM1高表达于肝细胞肝癌组织中而不表达于癌旁组织，在低分化癌组织中表达更显著，且抑制FoxM1表达能够下调肝癌细胞株分泌甲胎蛋白。李佩琴等[12]采用qRT-PCR及免疫组织化学技术检测FoxM1，发现在食管鳞状细胞癌及癌旁组织中FoxM1表达水平存在明显差异，且下调KYSE-30细胞中FoxM1表达后，细胞增殖速度受抑制，认为FoxM1可能参与调控人食管鳞状细胞癌细胞KYSE-30的增殖。对于FoxM1与肺癌的关系，Xiu[13]等发现FoxM1在A549和H1299细胞中的表达上调，沉默FoxM1后可抑制经红外处理的A549和H1299细胞的迁移、侵袭及上皮-间质转化，认为FoxM1可能在人肺癌放射治疗抵抗中发挥作用。Hsieh等[14]发现在人类肺癌细胞中，FoxM1与MED28相互作用，二者均可促使基质金属蛋白酶2基因表达水平升高，从而增强NSCLC细胞的迁移、侵袭能力，与本研究FoxM1与肺腺癌进展、转移密切相关的观点具有一致性。此外，FoxM1还属于调节氧化应激反应的重要基因之一，可在多种呼吸系统疾病对应组织或细胞中存在表达，并进行DNA复制和有丝分裂，如Tahmasbpour等[15]的近期研究发现慢性阻塞性肺疾病患者肺组织中也存在FoxM1表达，且长期过度表达可促进癌变，导致肿瘤细胞增殖，增加肺癌风险，也从另一个角度阐释了FoxM1与肺腺癌的关系。

同时，本研究发现COX-2在肺腺癌组织中阳性表达率均明显高于癌旁组织，且与肺腺癌患者TNM分期、淋巴结转移有关，表明肺腺癌组织中COX-2表达增高，与肿瘤进展、淋巴结转移密切相关。国内张爱丽[16]等的研究也显示肺腺癌组织中COX-2表达与TNM分期、淋巴结转移，并认为可能与表皮生长因子等表达异常有关。李静[17]等的报道显示，43例表皮生长因子受体突变型晚期肺腺癌患者中COX-2表达阳性率高，为53.4%，但显示COX-2表达与肿瘤分化程度、临床分期等无明显相关性，与本研究有所出入，可能由样本量及患者肺腺癌分期等差异所致。近年来，COX-2的致癌性已被广泛报道，如Carvalho等[18]认为其主要通过促进前列腺素合成增多来实现，COX-2不但可经MAPK/ERK信号通路抑制凋亡、促进血管生成及转移，而且能够直接活化表皮生长因子受体及促使其过表达。张蕊[19]等的研究表明，在肿瘤微环境中髓样细胞触发受体-1(具有参与肿瘤免疫调节的作用)的表达依赖于COX-2信号通路，抑制COX-2可引起髓样细胞触发受体-1表达衰减，继而可能促进肿瘤细胞逃脱特异性免疫应答。另有荟萃研究表明COX-2可指导恶性肿瘤的临床治疗，如食管癌中联合应用COX-2抑制剂能减少或抑制上皮-间质转化，或降低相关癌基因表达[20]；Gitlitz[21]等发现COX-2过表达的NSCLC中，联合应用COX-2抑制剂能改善对酪氨酸激酶抑制剂耐药。

由以上分析可知，FoxM1与COX-2的分子机制不同，故本研究相关性分析显示肺腺癌组织中FoxM1与COX-2表达无明显相关性，提示二者可能不存在协同作用。此外，本研究进一步随访及进行Kaplan-Meier法、COX回归模型分析，结果显示随访至少48个月，FoxM1阳性、COX-2阳性表达者生存率均明显高于阴性表达者，且除了常规指标TNM分期、淋巴结转移以外，FoxM1和COX-2阳性也被证实是肺腺癌预后的影响因素，故认为二者均可能成为预测肺腺癌侵袭性、生物学行为及判断预后的指标，且二者可能成为新的药物作用靶点，为肺腺癌的个体化用药选择提供新的思路。由于本研究样本量较小，随访期较短，相关结论仍进一步论证，且FoxM1与COX-2的分子机制仍需深入探究。