邱肖华，吴依莎，朱政泽，张泛舟，陈银滢，余作龙，活泼

（浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江杭州310015）

随着人们对食品包装材料造成的食品安全和环境承受能力等问题关注，使安全、环保的食品包装膜成为研究热点，尤其是近年对可食性包装膜研究较多。可食性包装膜分为蛋白质类、多糖类、类脂类以及复合膜[1-3]，采用天然多功能活性成分取代人工合成及传统的单功能食品添加剂已成为国内外食品科学研究的新热点[4-5]。其中淀粉基可食膜是以淀粉（starch film，St）（主要是直链淀粉）为基质，以多元醇（如甘油、山梨醇、聚乙二醇等）及类脂物质（如脂肪酸、单甘油脂、表面活性剂等）为增塑剂，少量动植物胶（如褐藻胶、琼脂等）为增强剂制作而成[6]。淀粉基膜具有绿色环保、安全无毒、可生物降解等特点，是当今最具发展前景的材料之一。

着-聚赖氨酸（epsilon-poly lysine，PL）作为一种微生物源的天然防腐剂，可由微生物菌株Streptomyces albulus No.346 发酵制得[7]，具有安全、高效、水溶性好、抗菌谱广等优点[8]。PL 对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母和霉菌都有抑制作用[9]，是一种天然的抑菌剂[10]。

通过PL 对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌的抑菌试验，得出PL 对3 种菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），并参考获得的MIC，制备不同浓度的PL/St 抑菌膜，以前期获得的St膜配方为参考制膜，并进行抑菌性试验，筛选出最佳的抑菌膜。对筛选出的抑菌膜进行性能检测，并与St膜进行比较，为PL/St 抑菌膜在功能性包装膜的应用领域提供参考。

1 材料和方法

以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌等，3 种菌为研究对象，采用打孔法，以抑菌圈为指标，对PL 的抑菌性能进行研究。

1.1 材料和设备

1.1.1 试验菌种

大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和酵母菌（Yeast）。试验菌种由浙江树人大学微生物实验室提供。

1.1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠 5 g，琼脂粉 20 g，水 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

细菌基础培养基（luria-Bertani，LB）：蛋白胨 10 g，酵母膏 5 g，氯化钠 10 g，琼脂粉 20 g，水 1 000 mL，pH 7.0～7.4。

酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：葡萄糖 20 g，酵母提取物 10 g，蛋白胨 20 g，琼脂粉 20 g，水 1 000 mL，pH 5.0。

1.1.3 材料和试剂

豌豆淀粉（食品级）：烟台东方蛋白科技有限公司；甘油（食品级）：浙江杭州双林化工试剂厂；海藻酸钠（食品级）：山东精协海洋科技发展有限公司；着-聚赖氨酸（食品级）：南京轩凯生物科技有限公司；牛肉膏、酵母膏：北京双旋微生物培养基制品厂；蛋白胨：南京茂捷生物科技有限公司；酵母提取物：合肥强盛生物科技有限公司；葡萄糖：广东光华科技股份有限公司；氯化钠：上海试四赫维化工有限公司；琼脂粉：杭州木木生物科技有限公司，以上均为分析纯。

1.1.4 仪器和设备

SW-CJ 超净工作台：苏州净化设备有限公司；GI54DW 高压蒸汽灭菌锅：美国Zealway Instrument Inc（致微）仪器有限公司；SPX-250B-Z 生化培养箱、BGZ-140 烘箱：上海博迅实业有限公司；PL303 电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；QYC-2102C/KYC-1102C 摇床：上海福玛设备有限公司；BCD-186KB 冰箱：青岛海尔股份有限公司；TA.XT plus物性仪：北京微讯超技仪器技术有限公司；07HWS-2数显恒温磁力搅拌器、JHS-2/90 恒速数显搅拌机：杭州仪表电机有限公司；MB45 卤素水分仪：奥豪斯仪器（上海）有限公司；MCR102 流变仪：奥地利安东帕（中国）有限公司；BRUKER 红外光谱仪：德国布鲁克光谱仪器公司；JC2000D3 接触角测量仪：上海中晨数字技术设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备

用接种环挑取2～3 环已活化培养24 h 的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和培养48 h 的酵母菌分别于无菌生理盐水中制成菌体浓度为107cfu/mL～108cfu/mL 的菌悬液。

1.2.2 PL 溶液的配制

精确称取 PL，分配配制成浓度为 0、0.25、0.5、0.75、1、2、4、8、16、32、64 mg/mL 的 PL 溶液，待用。

1.2.3 含菌平板的制作

分别配制牛肉膏蛋白胨培养基、LB 培养基、YPD培养基和素琼脂。待所需物品及培养基灭菌后，在超净工作台中，先倒一层素琼脂，大约5 mL。待其凝固后，放上牛津杯（牛津杯需在酒精灯火焰上快速过一下）。待培养基的温度适宜后，倒入平板，用移液枪分别移取各上述菌悬液100 μL 加入其对应的培养基中，快速摇匀，制成混菌平板，并做好标记。静置待培养基凝固后，小心拔出牛津杯，待用。

1.2.4 PL 的 MIC 测定

采用平板打孔法[11-13]。将配制好的PL 溶液，用移液枪移取不同浓度的PL 溶液100 μL 于平板的孔内（每个平板3 个孔，每个浓度两个平行），每种培养基增加一组无菌生理盐水为空白对照。将平板放入恒温培养箱中培养，大肠杆菌与枯草芽孢杆菌置于37 ℃，酵母菌置于30 ℃，培养24 h～48 h 后，观察试验结果。

1.2.5 PL/St 抑菌膜的制备

100 mL 水溶液中添加 11 g 豌豆淀粉、1.2 mL 甘油0.4 g 海藻酸钠，在 95 ℃下，300 r/min 搅拌 30 min[14]，待淀粉糊化后，加入抑菌剂PL，搅拌10 min，经真空脱气工艺脱气后，流延铺膜于钢板上，并在50 ℃烘干，揭膜，储存待用。

1.2.6 PL/St 膜抑菌性研究

分别配制3 种培养基，加热融化并分装入三角瓶中，将培养皿、涂布棒等物品包好后一起灭菌，然后在超净工作台中倒平板并做标记，冷却。用移液枪分别移取各上述菌悬液10 μL 加入对应的培养基中，涂布均匀，静置使其渗入。用打孔器将制备的不同浓度的抑菌膜打成小圆片（大约3 mm），小心放置于涂有菌的平板上，在恒温培养箱中，培养24 h～48 h，观察平板抑菌圈的大小，衡量膜的抑菌性[15]。

1.2.7 膜厚度测定

选择平整、均匀、无孔洞、无皱褶的膜，用螺旋测微器（精度0.01 mm）测样品的4 个顶点和中心点上的厚度，然后取5 个值的平均值，即为膜的厚度，单位为mm[16]。

1.2.8 抗张强度与断裂延伸率测定

按照GB/T 1040.3-2006《塑料拉伸性能的测定第3 部分：薄塑和薄片的试验条件》[17]，将样品裁成长10 cm，宽0.5 cm 的长条，用物性仪测定膜的拉伸强度（TS）和断裂延伸率（E），每组测垂直方向横纵各3 条，共6 个平行样，计算平均TS与E。标距为50 mm，试样速度为100 mm/min。

式中：TS为抗拉强度，MPa；F 为膜所受拉力，N；S为膜的横截面积，m2。

式中：E 为断裂延伸率，%；L0为试样原始标准距离，mm；L 为试样断裂时标准距离，mm。

1.2.9 傅立叶红外光谱分析（fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）

剪一小片制得的抑菌膜样品，然后进行红外光谱扫描，考察膜的组分对膜结构的影响。采集条件为：25 ℃下，以 4 cm-1分辨率，在 500 cm-1～4 000 cm-1波数范围内，扫描32 次，得红外光谱图。

1.2.10 流变性能

将糊化后的膜液倒入流变仪中，在流变仪上装cp转子，设定测得温度为80 ℃，按设定程序进行操作，测得流变曲线。其中，黏度曲线模型为：

式中：η 为黏度，Pa·s；γ 为剪切速率，s-1；k 为稠度系数，与黏度相关的常数；n 为流动指数。

1.2.11 水蒸气透过系数的测定

透湿率即在规定的温度、相对湿度环境中，在单位压差下、单位时间内透过单位面积和一定厚度膜的水蒸汽量。根据塑料薄膜及片材透水蒸汽试验方法的原理和步骤，采用GB1037-1988《塑料薄膜和片材透水蒸气性试验方法杯式法》[18]拟杯子法，具体方法为：在25 ℃条件下，于称量瓶中放入无水氯化钙，氯化钙使用前应粉碎，使其粒度为2 mm，并在200 ℃条件干燥2 h，冷却，然后称取一定量的氯化钙于称量瓶中。选平整、均匀、无孔洞、无皱褶的膜，测量其厚度后，用熔化的石蜡将其封于口上，然后放入相对湿度为100%的干燥器中，测量温度为25 ℃，每隔24 h 后取出称重，连续测量一周。每一组做至少3 个平行试验，结果以每组的算术平均值表示。

式中：WVP（water vapor permeability）为透水系数，g·mm/m2·d·KPa；Δm 为稳定的质量增量，g；d 为膜的厚度，mm；A 为有效测定面积，m2；t 为测量时间间隔，d；ΔP 为试样两侧的水蒸汽压差，KPa。

1.2.12 透油性研究

取约5 mL 色拉油置于试管中，以待测膜封口，倒置于滤纸上，放置一周，每天称量滤纸质量的变化，按下式计算透油系数（Poil）[19]：

式中：Poil 为透油系数，g·m/m2·d；Δm 为滤纸质量的变化，g；d 为膜厚，mm；A 为膜的面积，m2；T 为放置时间，d。

1.2.13 接触角

假定不同的界面间力可用作用在界面方向的界面张力来表示，则当液滴在固体平面上处于平衡位置时，这些界面张力在水平方向上的分力之和应等于零，即：

式中：γS/A 为固-气界面张力，N；γL/A 为液-气界面张力，N；γS/L 为固-液界面张力，N；θ 为液体与固体间的界面和液体表面的切线所夹（包含液体）的角度，°。

液体与固体间的界面和液体表面的切线所夹（包含液体）的角度，称为接触角。接触角是反应物质与液体润湿性关系的重要尺度，当θ=0，完全润湿；当θ＜90°，部分润湿或润湿；当 θ=90°，是润湿与否的分界线；当 θ＞90°，不润湿；当 θ=180°，完全不润湿。

2 结果与分析

2.1 PL的MIC

着-聚赖氨酸对3 种菌的最低抑菌浓度见图1。

图1 ε-聚赖氨酸对3 种菌的最低抑菌浓度Fig.1 MIC of PL solution for different microorganisms

图1 试验结果表明，PL 对3 种菌都有明显的抑菌作用，但对 3 种菌的 MIC 不同。PL 浓度为 1 μg/mL 时，对大肠杆菌表现出抑菌作用；PL 浓度为2 μg/mL 时，对枯草芽孢杆菌和酵母菌表现出抑菌作用。

PL 对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌均有良好的抑菌效果。不同着-聚赖氨酸浓度的膜对3 种菌的抑菌圈直径见图2。

图2 不同ε-聚赖氨酸浓度的膜对3 种菌的抑菌圈直径Fig.2 The inhibition zone diameter of films with different concentrations of PL to different microorganisms

根据图2 可得，对大肠杆菌的抑菌效果最佳，枯草芽孢杆菌和酵母菌其次。PL 的抑菌机理在于破坏微生物的细胞膜结构，造成细胞壁与细胞质分离，菌体塌陷，细胞质溢出等现象，破坏菌体正常生理代谢，引起细胞的物质、能量和信息传递中断，与细胞内部物质发生作用，破坏细胞核心，造成紫外吸收物溢出，最终导致细胞死亡[20]。在3 种菌中，产生差异主要原因是细胞壁的不同厚度和组分造成。

2.2 PL/St膜的抑菌性

含着-聚赖氨酸的St 膜最低抑菌浓度见图3。

图3 含ε-聚赖氨酸的St 膜最低抑菌浓度Fig.3 MIC of St films with different concentrations of PL to different microorganisms

从图3 抑菌性结果来看，浓度为32 mg/g 的PL 抑菌膜对3 种菌有微弱的抑菌性。浓度为64 mg/g 的PL抑菌膜对3 种菌都有着明显的抑菌性，抑菌圈的环形区域较大，说明该浓度抑菌膜具有良好的抑菌效果。单一的St 膜并不具备抑菌效果，而在淀粉糊化后，加入PL 作为抑菌剂，能对St 膜的抑菌效果得到改善，使其具有抑菌性。PL/St 抑菌膜的抑菌效果，随着PL 的浓度增大而增强。

PL/St 膜的浓度为64 mg/g 时，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌都有明显的抑菌效果，且抑菌性较强，但和PL 的抑菌性相比，其抑菌膜的浓度提高较大，原因是PL 溶液能较好地与培养基接触并渗透到培养基中，而膜只有表面和边缘接触，导致MIC 提高较大。选用浓度64 mg/g 的抑菌膜来进行性能检测，并与St 膜进行对比。

2.3 膜性能检测

2.3.1 抗拉强度和断裂延伸率

抗拉强度和断裂延伸率见图4。

图4 抗拉强度和断裂延伸率Fig.4 Tensile strength and elongation

如图4 结果表明，两种膜相比，St 膜的抗拉强度（Ts）较好，PL/St 膜的断裂延伸率（E）有所提高。原因在于所用着-聚赖氨酸的分子量只有5 000 Da，而淀粉的分子量达到了几百万，在搅拌的过程中，PL 能呈现分子状态[21]，能较好的进入淀粉分子的间隙之中，降低产品的刚性，增加其的柔韧性，起到松弛大分子的作用，从而使Ts 降低、E 增加。

2.3.2 水蒸气透过率

水分透水速率和水分透过系数见图5。

图5 水分透水速率和水分透过系数Fig.5 Water vapor transmission rate and water vapor permeability

如图5 研究结果表明，St 膜和PL/St 抑菌膜的水蒸气透过率和水蒸气透过系数都较大，说明St 膜和PL/St 抑菌膜的阻湿性能较差，PL/St 抑菌膜的透水速率与透水系数均比淀粉膜的要大，原因是由于PL 是亲水性的阳离子多聚物，还有大量的极性氨基酸，具有较强亲水性，着-聚赖氨酸分子分散在淀粉分子中间，增强了水分的渗透作用，故PL/St 抑菌膜的阻湿性要比淀粉膜差。

2.3.3 透油性

试验过程中，通过称量滤纸片的质量来判断透油性。膜的透油性见图6。

图6 两种膜的透油性Fig.6 Oil permeability of two different films

St 膜和PL/St 抑菌膜第2 天滤纸片的重量与第1天相比，都稍有下降，原因可能是滤纸本身水分含量会因为环境中水分湿度的改变而改变，之后几天滤纸片的重量没有太大的的变化。可以认为St 膜和PL/St抑菌膜的透油性为0。试验结果表明，St 膜和PL/St 抑菌膜都有着非常好的阻油性。

2.3.4 FTIR 分析

膜的红外光谱分析见图7。

图7 膜的红外光谱分析Fig.7 FTIR spectra of different films

从文献[22]可知，淀粉在 3 360、2 928、1 646 、1 021 cm-1处有特征吸收峰。PL 在 3 382、3 362、3 081、1 633、1 535 cm-1处有特征吸收峰[23]。3 460 cm-1处为-OH 的振动吸收峰，2 938 cm-1处为C-H 键的伸缩振动峰，1 210 cm-1处为C-O 伸缩振动吸收峰。1 100 cm-1处为C-O-C 的伸缩振动吸收峰。由于添加抑菌剂等小分子质量分数较小，对质量比较高的大分子淀粉分子的作用力影响较小，红外光谱分析分子间较弱的相互作用力的表现较弱。

2.3.5 流变性能

膜的流变性能检测见图8。

图8 膜的流变性能检测Fig.8 Rheological curve of different film fluids

如图8，当样品膜液糊化完成后，随着剪切速率的增大，膜液的粘度经过先平稳后急剧下降再缓慢下降等过程，说明在0.3 s-1时，膜液发生剪切变稀现象，具有非牛顿流体特性。由于抑菌剂的添加量较少，与淀粉膜液相比，流变性有一定差异，但总体流变性基本一致。

2.3.6 接触角

St 膜液和PL/St 膜液的接触角见图9。

图9 两种膜液的接触角Fig.9 Contact angle of two different film fluids

如图9 所示，经过接触角测量仪的测量，得出的数据结果为：淀粉膜液的接触角为123.19°，PL/St 膜液的接触角为125.61°。从试验结果可以得出，St 膜液和PL/St 膜液的接触角都较大，揭膜的难易程度相差较小，都比较容易揭膜。

3 结论

本文研究PL 的抑菌性并借鉴前期的制膜方法对PL 加入到St 膜中的各种性能进行研究，结果表明：PL对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌的MIC 分别为1、2、2 μg/mL；St 膜中加入抑菌剂 PL 对 St 抑菌膜的抑菌性有着较好效果，浓度为64 mg/g 的PL/St 膜对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌有着明显的抑菌作用；PL/St 抑菌膜与St 膜相比，抗拉强度下降，但断裂延伸率有所提升。PL/St 膜与St 膜的阻湿性均较差，均有较好的阻油性；力学性能测试、红外表征、流变性和接触角检测表明添加少量的PL 对St 膜性能影响较小。