方美蓉, 秦利梅, 贾晓博, 李永生, 牛德超, 胡泽岚

聚乙烯亚胺改性的双介孔氧化硅基因载体构建

方美蓉1, 秦利梅2, 贾晓博2, 李永生2, 牛德超2, 胡泽岚1

(华东理工大学1. 药学院, 上海新药设计重点实验室; 2. 材料科学与工程学院, 上海 200237)

为了开发一种新型的非病毒无机基因载体, 采用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTMS)和聚乙烯亚胺(PEI)对嵌入型双介孔氧化硅球(EDMSNs)进行改性, 分别得到EDMSNs-NH2和EDMSNs-PEI, 并比较了两种载体结合和保护pCMV-EGFP-N1质粒(pDNA)的能力及细胞转染性能。利用透射电镜、动态光散射及氮气吸附-脱附实验对材料的颗粒形态, 动力学粒径, Zeta电位及孔结构参数进行表征。结果显示, EDMSNs-NH2和EDMSNs-PEI均表现出明显的双介孔结构, 形貌为规整的球形且平均动力学粒径分别为343.2和338.9 nm, 表面电位分别为+18和+43 mV。琼脂糖凝胶电泳、CCK-8法及荧光显微镜结果表明, EDMSNs-PEI对pDNA的担载量为8%, 远高于EDMSNs- NH2(1%)。与PEI和lipofectamine2000相比, EDMSNs-PEI载体展示出更低的细胞毒性。EDMSNs-PEI/pDNA质量比为33 : 1时, EDMSNs-PEI/pDNA对293T细胞的转染效率在72 h达到最大值。因此, 与EDMSNs-NH2相比, EDMSNs-PEI具有更高的正电位及pDNA担载量, 可作为一类有前景的非病毒无机类基因载体用于重大疾病如恶性胶质瘤的治疗。

双介孔氧化硅球; 聚乙烯亚胺; 基因治疗; 恶性胶质瘤

传统的手术治疗、放疗和化疗对恶性肿瘤的治疗往往效率低、毒副作用大[1-2]。因此, 寻求新的肿瘤治疗方法以达到更好的治疗效果仍然是该领域面临的重大挑战之一。近年来, 基因治疗通过将具有治疗功能的核酸分子递送到细胞或靶向部位以纠正或修改遗传信息, 被广泛认为是在遗传水平上治疗癌症极富前途的方法。为实现将核酸递送至细胞中, 基因载体不仅要具备良好的生物相容性, 而且能保护核酸不被体内外的核酸酶降解[3]。目前, 基因载体主要包括病毒载体和非病毒载体两大类, 其中病毒载体具有较高的细胞转染效率, 但因安全性问题和制备成本昂贵, 限制了其进一步应用。与病毒载体相比, 非病毒载体在安全性和可控制备方面具有明显优势, 并广泛应用于基因转染和肿瘤基因治疗[4-5]。如Shi等[6]开发了一种精氨酸–甘氨酸–天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)多肽和聚乙烯亚胺(PEI)共修饰的金纳米载体, 能够将Bcl-2(B细胞淋巴瘤-2) siRNA转运至人脑胶质瘤细胞, 并且由于RGD多肽介导的靶向作用导致其在靶细胞中特异性基因沉默。

在众多的非病毒基因载体中, 介孔氧化硅生物载体具有细胞毒性小, 孔道内部和表面易被不同基团修饰[7-8], 孔径可调[9-10]等特点, 在药物担载及输运方面具有明显的优势。对其表面功能化修饰, 可实现对治疗性核酸[11-12]类生物大分子或小分子药物[13]的装载, 在降低细胞毒性的同时提高药物的抑瘤效果。Li等[10]通过把阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)和融合肽(KALA)修饰的磁性介孔二氧化硅纳米粒子(M-MSNs)作为VGEF-siRNA递送系统, 有效降低靶基因VEGF在体外的表达和抑制肿瘤血管在体内形成。最近, 本课题组成功制备出一种具有新颖多孔结构的嵌入型双介孔氧化硅球, 即小孔孔道位于大孔孔道的骨架中, 并分别以氨基和羟基对大小孔径进行修饰, 实现对亲/疏水药物分子(盐酸阿霉素/姜黄素)的共同担载[14]。然而, 利用该嵌入型双介孔氧化硅球的大孔结构对生物大分子(如质粒、蛋白质等)的担载和运输研究还未见文献报道。

为实现作为基因载体的功能, 我们分别制备了3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTMS)和聚乙烯亚胺(PEI)改性的嵌入型双介孔氧化硅球, 并研究了其对pCMV-EGFP-N1(6.1 kbp)质粒的担载与运输性能, 以期为构建同时担载生物大分子和小分子药物的新型硅基纳米生物载体提供新的思路和方法。

1 实验方法

1.1 改性的介孔氧化硅材料

1.1.1 嵌入型双介孔氧化硅球(EDMSNs)

根据我们之前的文献报道[14], 将100 mg PS92--PAA16(嵌段共聚物聚苯乙烯--聚丙烯酸: 采用原子转移自由基聚合方法制备得到[15])溶于10 mL THF中, 充分搅拌后加入40 mL含 CTAB 100 mg的碱性水溶液(0.5 mL NH3·H2O)中, 形成乳白色溶液。搅拌一段时间后将乳白色溶液加入含有0.3 g TEOS的80 mL乙醇溶液中。静置18 h后, 离心收集产物, 并用无水乙醇和盐酸萃取去除有机模板剂, 最终得到样品EDMSNs。

1.1.2 PEI改性的EDMSNs

将10 mg EDMSNs分散在10 mL超纯水中, 加入200 µL NH3·H2O和5 µL三甲基异硫氰酸基硅烷, 搅拌24 h, 得到NCO-EDMSNs; 将上述10 mg NCO-EDMSNs分散于10 mL乙醇中, 加入2 mg PEI, 搅拌24 h, 最终得到EDMSNs-PEI。

1.1.3 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTMS)改性的EDMSNs

70 mg EDMSNs溶解在30 mL甲苯中, 在80 ℃、N2保护下加入0.3 mL APTES, 继续通N23 h后, 关闭N2, 反应7 h。离心, 醇洗, 45 ℃干燥, 最终得到EDMSNs-NH2。

1.2 EDMSNs的表征

1.2.1 形貌和孔结构分析

使用JEM-2100透射电子显微镜在100 kV的加速电压下获得TEM照片, N2吸附-脱附在77 K温度下使用Micromeritics Tristar II 3020 system完成。

1.2.2 粒径和表面电位测定

将纳米材料用超纯水配制成10 mg/mL的溶液, 测定时用pH=7.4超纯水稀释成1 mL。采用Zeta potential/particle Sizer测定粒径和表面电荷。

1.3 EDMSNs-NH2和EDMSNs-PEI与pDNA的纳米复合物制备和稳定性检测

将EDMSNs-NH2和EDMSNs-PEI质粒(1 µg)分别按照质量比(200 : 1, 100 : 1, 50 : 1, 34 : 1, 25 : 1, 12.5 : 1, 5 : 1)混合在pH=7.4的PBS缓冲溶液中。配制两份, 放置在摇床中, 140 r/min、30 min振荡混匀后, 其中一份加入DNaseI, 37 ℃, 生化培养箱继续孵育30 min。电泳条件: 1×TAE缓冲液, 电压110 mV,电流100 mA, 30 min后在凝胶电泳成像仪上观察DNA的条带。

1.4 EDMSNs-PEI的细胞毒性

以人肾上皮细胞(293T)和人脑胶质瘤细胞(u87)为细胞模型, 37 ℃、5%的二氧化碳培养箱孵育24 h, 除去培养基, 分别加入PEI、lipofectamine2000或EDMSNs-PEI DMEM溶液(浓度为15.6~250 µg/mL), 孵育24 h后, 每孔加入10 µL CCK-8试剂, 继续孵育1.5 h后在酶标仪上450 nm处读取OD值, 并计算细胞活力。

1.5 EDMSNs-PEI/pDNA在293T细胞上的转染研究

以293T细胞为细胞模型, 37 ℃、5%的二氧化碳培养箱孵育24 h后, 加入含质粒(2 µg)的质量比为33 : 1的EDMSNs-PEI/pDNA纳米复合物。此外, 按照试剂说明书配制的lip2k (lipofectamine2000)质粒复合物作为对照, 孵育48 h, 72 h后用荧光显微镜观察转染效果。

1.6 统计学方法

使用Prism graphpad 5.0进行数据统计学分析,<0.01, 认为数据有显著性统计学差异。

2 结果和分析

2.1 EDMSNs-PEI和EDMSNs-NH2的表征

从透射电镜结果(图1)可以看出, 经PEI和APTES改性后的EDMSNs-PEI和EDMSNs-NH2均呈现规整的球形形貌和均匀的介孔结构, 且孔道分布均匀, 颗粒未出现团聚现象。从动态光散射仪(DLS)结果可以看出(图2), EDMSNs-PEI和EDMSNs- NH2的动力学粒径分别为338.9和343.2 nm。Zeta电位结果显示, 经PEI和APTES改性后样品的表面电位由负值变为正值, 表明PEI和氨基被成功嫁接到EDMSNs的孔道及表面。此外, EDMSNs-PEI和EDMSNs-NH2的Zeta电位分别为+43 mV和+18 mV。根据文献[16]报道, 纳米颗粒的Zeta正电位越大, 越有利于提高转染效率。因此, 具有高正电位的EDMSNs-PEI更有利于基因的担载及输运。

图1 EDMSNs-PEI(a)和EDMSNs-NH2(b)的透射电镜照片

图2 EDMSNs, EDMSNs-PEI和EDMSNs-NH2的Zeta电位(a)和动力学粒径分布(b)

氮气吸附脱附曲线表明(图3(a,c)): 在相对压力0.6~0.8处, EDMSNs-PEI和EDMSNs-NH2均出现吸附量突跳现象, 且有明显的滞后环, 表明两类载体均具有丰富的大介孔结构。采用Density Functional Theory(DFT)法计算样品的孔径分布, 结果显示: EDMSNs-PEI和EDMSNs-NH2均存在2.5 nm的小介孔, 且大介孔孔径为10.8和11.6 nm, 为后续质粒担载提供了保障。采用Brunauer-Emmett-Teller (BET)法计算样品的比表面积得到, EDMSNs-PEI的比表面积和孔容分别为734.7 m2/g和1.46 cm3/g。相比之下, EDMSNs-NH2的比表面积和孔容较低, 其数值分别为567.3 m2/g和1.26 cm3/g。而这种比表面积和孔容的小幅度下降可能归结于氨基改性过程中高温回流对部分孔结构的破坏。

图3 EDMSNs-PEI (a~b)和EDMSNs-NH2 (c~d)的氮气吸附–脱附曲线及相应的DFT孔径分布

2.2 EDMSNs-PEI和EDMSNs-NH2对pDNA的担载以及纳米复合物稳定性研究

图4(a)为纳米复合物凝胶电泳结果, 当EDMSNs- PEI和EDMSNs-NH2与pDNA的质量比均为5 : 1时, 在紫外灯的照射下能观察到清晰的DNA条带, 表明未能有效地包裹pDNA; 当EDMSNs-PEI/ pDNA质量比增加至12.5 : 1时, 未见明显的条带, 说明pDNA被完全包裹, 其装载量为8%。而对于EDMSNs-NH2/pDNA, 质量比为100 : 1时, 明亮的条带才消失, 其pDNA装载量为1%, 明显低于EDMSNs-PEI。这可能是因为PEI为高分子量阳离子聚合物, 其改性的EDMSNs孔道和表面具有更多的氨基, 提供更多pDNA担载位点, 从而实现更高的pDNA担载量。

进一步用脱氧核糖核酸酶DNaseI处理质量比大于12.5 : 1的EDMSNs-PEI/pDNA纳米复合物, 凝胶电泳结果显示(图4(b)): 在C泳道中的pDNA经DNaseI核酸酶剪切后, 未出现条带; 而8~13泳道的EDMSNs-PEI/pDNA纳米复合物经DNaseI核酸酶剪切后, 条带无迁移, 表明EDMSNs-PEI能保护pDNA不被核酸酶降解。此外, 通过测试EDMSNs- PEI/pDNA纳米复合物在不同质量比下(25 : 1~ 100 : 1)的Zeta电位发现, 当EDMSNs-PEI/pDNA质量比为33 : 1时, 纳米复合物Zeta电位由负值变为正值(图 4(c)), 进一步说明pDNA已被全部包裹在EDMSNs-PEI中。

2.3 EDMSNs-PEI的细胞毒性

图5为EDMSNs-PEI对人脑胶质瘤细胞(u87)和人肾上皮细胞 (293T)细胞的毒性影响。在293T细胞上, PEI 25kD只有在较低的浓度下(≤15.6 µg/mL)的细胞活力在80%左右, LIP2K在浓度≤31.25 µg/mL时细胞活力在80%左右。相比之下, EDMSNs-PEI浓度为125 µg/mL时, 细胞活力在80%左右。在u87细胞上, PEI 25kD、LIP2K和EDMSNs-PEI的细胞毒性实验结果与293T细胞基本一致。综上结果表明, EDMSNs-PEI具有更好的生物相容性和更低的细胞毒性。

2.4 EDMSNs-PEI的细胞转染

结合上述凝胶电泳结果, 以EDMSNs-PEI与pDNA 的质量比为33 : 1的纳米复合物来研究其细胞转染。从荧光显微镜照片(图6)可以看出, 孵育48 h, EDMSNs-PEI/pDNA实验组开始表达EGFP绿色荧光蛋白, 并在72 h达到最大值。尽管其转染效果低于脂质体lip2k对照组, 明场显微镜照片显示, lip2k对照组在转染72 h后出现细胞增值减弱, 呈现细胞脱落的状态。反之, EDMSNs-PEI/pDNA实验组的细胞状态良好, 且细胞增值不受影响。这一结果表明, 与lip2k对照组相比, EDMSNs-PEI/pDNA实验组具有更低的细胞毒性。

图4 EDMSNs-PEI/pDNA和EDMSNs-NH2/pDNA纳米复合物在不同质量比下的电泳照片(a), EDMSNs-PEI/pDNA DNaseI酶切电泳照片(b)和Zeta电位(c)

Weight ratio=weight ratios of EDMSNs-PEI and pDNA.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7: weight ratios of 5 : 1, 12.5 : 1, 25 : 1, 33 : 1, 50 : 1, 100 : 1, 200 : 1; 8, 9, 10, 11, 12, 13: weight ratios of 200 : 1 ,100 : 1, 50 : 1, 33 : 1, 25 : 1, 12.5 : 1 for EDMSNs-PEI/pDNA nanocomplexes treated with DNaseI

图5 PEI 25kD、LIP2K和EDMSNs-PEI在293T(a)和u87(b)上的细胞毒性

3 结论

本研究采用PS--PAA/CTAB双模板剂制备的嵌入型双介孔氧化硅球, 并分别进行PEI和APTES改性, 得到两种氨基化的多孔氧化硅球。EDMSNs- PEI和EDMSNs-NH2均具有规整的球形形貌和双介孔结构, 粒径均在340 nm左右且表面电荷为正值。凝胶电泳实验表明, 由于EDMSNs-PEI具有更高的正电位, 实现了对pDNA(6.1 kbp) 8%的担载量, 明显强于EDMSNs-NH2对pDNA的结合能力(1%)。同时, EDMSNs-PEI对pDNA的担载量也优于之前报道的改性的介孔二氧化硅纳米基因载体[12,17]。细胞转染实验显示, EDMSNs-PEI与pDNA形成的纳米复合物, 转染48 h后能在293T细胞中正常表达, 说明EDMSNs-PEI 能保护DNA不被溶酶体和核酸酶降解。此外, 尽管本研究中EDMSNs-PEI的转染效率仍低于商用转染试剂lipofectamine2000, 但其具有较低的细胞毒性, 是一类相对安全的非病毒硅基基因载体。综上, EDMSNs-PEI载体应用于基因传递的优势主要体现在两个方面: 一是对生物大分子质粒具有较高的担载量; 二是具有较低的细胞毒性。在后续的实验中, 我们将进一步通过调控EDMSNs的孔结构/孔径及优化PEI的担载工艺来提高其转染效果, 最终构建高性能硅基基因载体。

图6 EDMSNs-PEI/pDNA纳米复合物在293T细胞内的转染效果

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Construction of Polyethyleneimine-modified Dual-mesoporous Silica Gene Carrier

FANG Mei-Rong1, QIN Li-Mei2, JIA Xiao-Bo2, LI Yong-Sheng2, NIU De-Chao2, HU Ze-Lan1

(1. Shanghai Key Laboratory of New Drug Design, School of Pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China; 2. School of Materials Science and Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

To develop a new kind of non-viral inorganic gene vector, embedded dual-mesoporous silica spheres (EDMSNs) was modified with polyethyleneimine (PEI) or 3-aminopropyltriethoxysilane (APTMS). Then gene loading and transfection ability of the obtained EDMSNs-PEI and EDMSNs-NH2was tested by choosing the pCMV-EGFP-N1 plasmids (pDNA) as a gene model. Particle morphologies, particle sizes, zeta potentials, and pore structure parameters of EDMSNs-NH2and EDMSNs-PEI were characterized by transmission electron microscopy, dynamic light scattering and nitrogen adsorption-desorption. Both EDMSNs-NH2and EDMSNs-PEI display obvious dual-mesoporous structure and well-defined spherical morphology. Average dynamic sizes of EDMSNs-NH2and EDMSNs-PEI are 343.2 and 338.9 nm, while zeta potentials of EDMSNs-NH2and EDMSNs-PEI are +18 and +43 mV, respectively. The results ofgel electrophoresis, CCK-8 assay, and fluorescence microscope show that the pDNA loading amount of EDMSNs-PEI is 8%, much higher than that (1%) of EDMSNs-NH2. In addition, EDMSNs-PEI exhibits lower cytotoxicity than that of pure PEI polymers and lipofectamine2000. When the mass ratio of EDMSNs- PEI/pDNA is 33 : 1, the transfection rate of the 293T cells by EDMSNs-PEI/pDNA reaches a maximum at 72 h.In conclusion, EDMSNs-PEI, compared with EDMSNs-NH2, has a higher positive potential and pDNA loading capacity, which can be used as a promising non-viral inorganic gene vector for the treatment of diseases such as malignant glioma.

embedded dual-mesoporous silica spheres; polyethyleneimine; gene therapy;malignant glioma

TQ174

A

1000-324X(2020)02-0187-06

10.15541/jim20190099

2019-03-05;

2019-04-01

国家自然科学基金(51572083, 81772689); 上海市科技启明星计划(16QA1401300)

National Natural Science Foundation of China (51572083, 81772689); Shanghai Rising-Star Program (16QA1401300)

方美蓉(1993–), 女, 硕士研究生. E-mail: meirongfang@163.com

FANG Mei-Rong (1993–), female, Master candidate. E-mail: meirongfang@163.com

胡泽岚, 副教授. E-mail: huzelan@ecust.edu.cn; 牛德超, 副教授. E-mail: dcniu@ecust.edu.cn

HU Ze-Lan, associate professor. E-mail: huzelan@ecust.edu.cn;

NIU De-Chao, associate professor. E-mail: dcniu@ ecust.edu.cn