付彩萍，蒋咏梅，章文贤

（福建师范大学生命科学学院，工业微生物教育部工程研究中心，福建福州 350117）

微生物燃料电池（Microbial fuel cells，MFCs）是一种利用微生物将有机物中的化学能转化为电能的装置。其工作原理是微生物分解阳极室中的基质产生电子，电子通过合适的电子介质从胞内转移至阳极，再通过外电路传递至阴极，从而产生电流。由于MFCs能够将废弃物中的有机质转化为电能，有助于同时解决能源短缺和环境污染两大问题，因而受到广泛关注[1-2]。

1911年，Potter[3]首次发现微生物在代谢过程中产生电子。产电菌是微生物燃料电池的核心，截至目前已有20多个属相继被报道[4]。其中研究较多的有希瓦氏菌属（Shewanella）、地杆菌属（Geobacteracae）、红育菌属（Rhodoferax）、弧形杆菌属（Arcobacter）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）以及苍白杆菌属（Ochrobactrum）的菌株[5-6]。产电菌的电子传递机制与其种类密切相关，例如S.oneidensise通过自身产生细胞色素作为可溶性电子穿梭介体，这是典型的电子穿梭体介导的间接传递机制[7]；Geobactersulfurreducens等微生物利用类似纤毛或菌毛的导电物质，转移电子至胞外，此为纳米导线传递电子机制[8]。

进一步研究不同的产电机制有利于提高电子传递速率，而新的产电菌具有独特的生理特性和代谢功能，可在不同的领域发挥作用，如生物传感器、金属氧化还原等。因此，新型高效产电菌的分离筛选及生理特性研究具有重要意义。郑艳等[9]曾利用产电微生物还原磁黄铁矿中的铁。常见的电子受体主要有不溶性的铁/锰氧化物、腐殖质等大分子有机物和MFCs的电极3类，因此，产电菌广泛分布于铁/锰氧化物、腐殖质这些富含电子受体的区域及厌氧环境中，如铁锰矿山、土壤及海底沉积物等。本研究从铁锰矿样品中富集筛选具有产电性能的菌株，并对其产电性能进行了初步研究，优化其产电条件。

1 材料与方法

1.1 实验培养基

菌株 N-N 富集培养基：NH4NO31.0 g/L，NaNO30.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 0.2 g/L，柠檬酸三钠 2.0 g/L，琼脂 20 g/L，pH 7.0～7.2。

LB 生长培养基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母粉 15 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0～7.2。

阳极液采用M9培养基：Na2HPO4·12H2O 17.8 g/L，KH2PO43.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，NH4Cl 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.12 g/L，CaCl20.01 g/L 和碳源；阴极液采用0.1 mol/L铁氰化钾溶液：铁氰化钾32.92 g/L，KCl 5.6 g/L，Na2HPO4·12H2O 17.8 g/L，KH2PO43.0 g/L。

1.2 菌株分离与鉴定

取铁锰矿石样品和阳极溶液组装电池，待运行稳定后，取少量阳极碳毡生物膜在N-N富集培养基上稀释涂布、培养。挑取形态差异明显的单菌落，分离4～5次直至得到纯菌株。分别接种至MFCs检测其产电能力。

选取产电效果较好的MFCs，阳极室的菌液分离纯化后送至福州鼎国生物技术有限公司，进行16S rRNA测序鉴定。基因序列在NCBI上BLAST比对并提交序列，选取同源性较高的参比序列，MEGA4.0进行同源序列比对，邻接法（NJ）构建系统发育树。

1.3 MFCs组装与运行

MFCs为有效容积100 mL的双室电解池，示意图如图1所示，Nafion 117质子交换膜中间隔开，阴、阳极碳毡面积2 cm×3 cm，0.5 mm钛丝作电子集流体，外电阻（R）为1000 Ω。培养12h的菌液离心，菌体接种至阳极液中，使其终浓度OD600为1.0，在磁力搅拌器上室温下运行。输出电压（U）以每分钟的频率用信号记录仪采集系统（MPS-010602）记录。

图1 微生物燃料电池装置示意图

1.4 电化学活性测试

1.4.1 极化曲线与功率密度曲线

MFCs运行稳定后，断开电路6～8h，依次连接阻 值 为 50000Ω、10000Ω、5000Ω、2000Ω、1000Ω、800Ω、500Ω、300Ω、200Ω、100 Ω 的电阻，运行30 min，记录对应外电阻的电压值U，绘制极化曲线及功率密度曲线。电流密度i和功率密度P根据公式1和公式2的欧姆定律计算获得，式中S为阳极碳毡的表面积。

1.4.2 循环伏安扫描

分别在阳极室中加入菌体和阳极液、12h培养菌液的上清液，组装MFCs，使用电化学工作站（CHI1040C）的三电极系统进行完整的循环伏安扫描。其中，工作电极为碳毡、对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl，扫描速率为0.01 V/s，电位限值为 -0.4～0.4 V，灵敏度为 10-3。

1.5 条件优化

1.5.1 生长培养基对菌株产电性能的影响

采用LB与N-N富集培养基，进行生长能力和产电性能的比较。

1.5.2 阳极液碳源对菌株产电性能的影响

M9阳极液中分别添加2 g/L可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、乙酸钠作为碳源，组装电池，测定电压；改变碳源浓度（0 g/L、2 g/L、4 g/L、8 g/L），组装电池，测定电压。

1.5.3 阳极液pH对菌株产电性能的影响

将阳极液pH分别调节至4、6、7、8、10，其他条件一致，组装电池，测定电压。

2 结果与讨论

2.1 产电菌株的分离与鉴定

从运行稳定的铁锰矿样品富集MFCs的阳极碳毡中，分离得到4个形态差异明显的菌株，分别命名为菌株F01，F02，F03，F04，其形态特征与产电能力如表1所示。菌株F04的产电效果最好。

表1 4株菌株的形态特征及产电能力

菌株F04的16S rRNA基因测序结果显示其序列长度为1428 bp，将该序列提交至GenBank（序列号为MN726711）。BLAST显示，该菌株分别与Pseudomonas putida strainM9、P.putida strain M7 及P.putida BN-St序 列 的 相 似 性 为 99.79%、99.86%和99.79%，这3个菌株均属于恶臭假单胞菌。由MEGA4.0构建系统发育树，如图2所示，发现该菌株与 P.putida strainM9（KF358272.1）序列同源性达100%，判断菌株F04为恶臭假单胞菌，将其命名为P.putida F04。

图2 菌株F04的系统进化树

2.2 条件优化

2.2.1 生长培养基对菌株F04产电性能的影响

分别在N-N、LB培养基中培养菌株P.putida F04，发现不同培养基对菌株的生长有明显影响，结果如图3所示。N-N培养基中，菌株的停滞期与对数期均较短，细胞数量在8 h之后便不再增加，稳定期较长。而在LB培养基中，菌株不仅生长繁殖速度快，且最终OD600达到2.8，是N-N培养基中的3.5倍。

分别取在N-N和LB培养基培养12h的菌体，与阳极液混合（OD600为1）加入阳极室，组装电池。MFCs在室温下运行一个周期，结果如图4所示。发现两种MFCs均在214 h达到最大电压，分别为158 mV（N-N）和 167 mV（LB），高于 100 mV 的持续时间分别为 253 h（N-N）和 315 h（LB）。由于两个MFCs的阳极室中起始菌体数量相同，可见LB培养基中培养的菌株产电性能较好，推测与LB培养基的营养较丰富有关。

图3 培养基对菌株F04生长曲线的影响

图4 培养基对菌株F04产电性能的影响

2.2.2 阳极液碳源对菌株F04产电性能的影响

碳源是微生物生长的基础，MFCs阳极室中的微生物分解碳源产生电子和质子，电子再经阳极至阴极的传递产生电流。因此，碳源的种类和含量差异会导致微生物的代谢途径和氧化还原反应发生变化，进而影响电子产生的快慢及产量的高低，最终影响MFCs的产电性能[10]。

不同碳源对P.putida F04产电性能的影响见图5。以乙酸钠作为碳源时，MFCs的输出电压极低且长时间低于20 mV。然而，Kim[11]在培养G.sulfurreducens时，只有乙酸作为碳源时菌株才生长且最高功率密度为13～16 mW/m2。可见碳源种类会对产电菌的适应性产生显著性影响。

以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉作为阳极液碳源时，MFCs产电较高，均达到100 mV以上；以葡萄糖为碳源的MFCs在60 h即可达到最大输出电压119 mV，用时最短；以可溶性淀粉为碳源的MFCs产电最高，294 h 电压达到 198 mV；以蔗糖作为碳源的 MFCs，93 h内电压达到189 mV。以葡萄糖、可溶性淀粉和蔗糖为碳源的MFCs的电压维持高于100 mV的时间分别为17h、53h和275 h。以上结果与3种碳源的相对分子质量和结构相对应，葡萄糖为单糖，能直接被微生物利用，因此达到最高电压的速度较快，但维持高电压的时间短。可溶性淀粉的分子结构较复杂，需要水解成小分子物质，才能被微生物代谢，故而达到最大电压值的时间较长。蔗糖为二糖分子，被微生物分解为果糖和葡萄糖，产电速率快，在52 h后蔗糖MFCs电压便递增，产电量较高。综合最大输出电压和产电速率考虑，将蔗糖作为P.putida F04产电的碳源进行后续研究。

在阳极液中加入不同浓度的蔗糖作为碳源，如图6所示，MFCs电压随蔗糖浓度的增大而上升。阳极液中碳源浓度为0时，MFCs几乎不产电；蔗糖浓度为2 g/L时，菌株输出电压在69 h升高至最大输出电压152 mV；8g/L蔗糖时菌株在后期稍有下降。整体来看，4 g/L蔗糖作为碳源，菌株的产电效果较好，最大电压达到217 mV。

图5 碳源种类对菌株F04产电性能的影响

图6 碳源浓度对菌株F04产电性能的影响

2.2.3 阳极液pH对菌株F04产电性能的影响

pH对微生物的生长具有极大影响，在MFCs中，阳极的pH值通过改变阳极液中的离子浓度、细胞内的酶活性和细胞膜所带电荷的状态，从而导致产电菌的底物代谢速率、产生电子的多少及生物膜的形成发生变化[12]。

将阳极液调至不同pH，运行MFCs，输出电压见图7。与 Tremouli[12]和 S.Veer Raghavulu[13]的结果类似，在中性环境下，P.putida F04产电性能最好，阳极液pH为7时，MFCs的最大输出电压为266 mV，且产电能力最为稳定；pH为8时，最大输出电压为180 mV，高于pH为6时最大输出电压的1.5倍，可见菌株P.putida F04更适应偏碱性环境，而偏酸性环境不利于其产电。由于强酸、强碱会破坏生物大分子的稳定性，影响细胞酶活性，不利于菌体的生长，导致阳极碳毡的生物膜难以形成，因而阳极液pH为4和10时，MFCs产电量极低。

图7 不同pH的MFCs输出电压

2.3 极化曲线和功率密度曲线

极化曲线和功率密度曲线是描述MFCs电化学性能的重要判断方法。随着外电阻减小，电流密度增大，外电压减少，功率密度先上升后下降[14]。当外阻与内阻相同时，面积功率密度最大，故通过功率密度曲线可获得MFC的内阻值[15]。

4 g/L蔗糖为碳源的MFCs的极化曲线与功率密度曲线见图8。开路电压为564mV，整体看来，电流密度与外电压之间呈线性相关，但区域1偏移拟合曲线，电压急剧下降，这是因电极氧化还原反应、细胞膜与电极间的电子传递过程造成的能量损失，引起的活化内阻。区域2电压二次降低，是因电极底物的消耗速率和底物的补给速率不同引起的传质内阻[16]。功率密度曲线中，电流密度为956 mA/m2，最大面积功率密度为 181.8 mW/m2，此时外电阻为 1000 Ω，由此判断，微生物燃料电池内阻为1000 Ω。

表2是菌株F04与首次被报道典型产电菌的产电性能的对比。为便于比较，面积功率密度单位统一为mW/m2。在已发现的产电菌中，以乳酸盐为碳源的Shewanellaoneidensis DSP10和以乙酸盐为碳源的Rhodopseudomonaspalustris DX-1的面积功率密度最高，分别为 3000mW/m2、2720 mW/m2，其他菌株面积功率密度多在30～400 mW/m2。经初步条件优化，菌株P.putida F04 产电面积功率密度达到 181.8 mW/m2。

2.4 循环伏安扫描

产电菌的氧化还原性是MFCs运行的关键。产电菌产生电子介质，将氧化还原过程中产生的电子传递到胞外的产电机制，是目前最具说服力的产电机理。而循环伏安法（cyclic voltammetry，CV）是用来检测微生物中是否有电子介质的常用方法[28]。

为进一步研究菌株P.putida F04的产电机制，将菌体和阳极液、上清液各进行了一次完整的循环伏安扫描，结果见图7。菌体和阳极液在-0.071 V、-0.270 V有明显的氧化峰和还原峰，而上清液未出现氧化还原峰，这表明传递电子的介质可能存在于菌体中。

图7 菌株F04的循环伏安曲线

3 结论

（1）本研究从铁锰矿样品中富集分离得到1株产电能力较强且运行稳定的菌株，鉴定并命名为P.putida F04。

图8 极化曲线与功率密度曲线

（2）菌株的生长培养基、阳极液的碳源和pH等参数对菌株P.putida F04的产电性能有较大影响。LB培养基有利于菌株生长；乙酸钠不利于MFCs产电；以葡萄糖为碳源时，MFCs在60 h内达到最大电压119 mV；以可溶性淀粉为碳源，MFCs高于 100 mV持续时间长，而在4 g/L蔗糖浓度阳极液下，菌株的产电速率较快且最大输出电压较高。菌株在中性环境下产电能力最强，最高可达到266 mV，酸性、碱性环境不利于产电。

表2 初次报道的产电菌的产电能力

（3）以4 g/L蔗糖为碳源时，菌株F04最大面积功率密度达181.8 mW/m2，内电阻为 1000 Ω。循环伏安扫描分析表明，传递电子的介质可能存在于菌体中，但具体的产电机制仍有待进一步研究。