张红丽，黄 靖，刘 霞，吴赟竑，冯肖肖，吴雪军，徐 辉

(浙江省动物疫病预防控制中心，浙江 杭州 311199)

鸭瘟，又称鸭病毒性肠炎，是由鸭瘟病毒引起的一种急性、高度接触性传染病，发病率和死亡率可达100%。鸭瘟病毒(duck enteritis virus，DEV)属于疱疹病毒目疱疹病毒科疱疹病毒甲亚科，可感染48种以上的雁形目水禽[1-2]。

鸭瘟病毒基因组为双股线状DNA，包括长独特区(unique long，UL)、短独特区(unique short，US)，以及内部和末端的反向重复序列，结构为UL-IRS-US-TRS[3]。鸭瘟病毒基因组全长约为160 kb，含有78个开放阅读框(open reading frame，ORF)，包含潜在的76个能编码功能蛋白的ORF。功能性蛋白主要分为结构蛋白和功能蛋白。囊膜蛋白是主要的结构蛋白，包括糖蛋白gK、gM、gN、gH、gB、gC、gL、gG、gJ、gD、gI、gE。除gC蛋白外，其他蛋白均为病毒囊膜的主要成分。糖蛋白具有吸附、传入敏感细胞、融合细胞并进行细胞间传播，同时携带抗原决定簇，可诱导机体免疫应答反应，造成机体组织的病理损伤。gB蛋白含有鸭瘟病毒的主要抗原位点，是淋巴细胞增生性应答的靶点，参与细胞免疫和体液免疫，是鸭瘟病毒的优势结构蛋白和主要的免疫原性蛋白，也是新型疫苗研究的靶抗原[3]。

对鸭瘟病毒进行全基因测序，与GenBank中发表的强毒株和弱毒株序列对比发现，UL2、UL12、UL41、UL47、US10基因在强毒株与弱毒株之间出现明显的序列差异，提示这5个基因可能与病毒毒力相关[4-5]。刘荣昌等[6]对福建2个疑似鸭瘟鸭场进行鸭瘟病毒分离，并对UL2基因进行序列测定与分析，发现分离的鸭瘟病毒具有强毒株的分子特征。许梦微等[7]利用LORF11在不同毒株的序列长度差异建立了鉴别诊断鸭瘟病毒的PCR方法。强弱毒株差异基因分析对鸭瘟毒株毒力分析具有重要意义。

2016年年初，浙江省一免疫过鸭瘟疫苗的蛋鸭场鸭群发病，病鸭表现为头肿，眼睑肿胀、流泪，剖检可见病鸭脾脏出血、坏死，食道黏膜、泄殖腔黏膜出血，疑似鸭瘟。经过PCR方法鉴定，确定该病毒为鸭瘟病毒。本研究通过高通量测序技术，对所获得的鸭瘟毒株进行测序，分析该毒株毒力基因序列，确定该毒株的主要功能基因序列特征，旨在为鸭瘟的诊断和防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

病死鸭肝脏、肺脏、十二指肠、输卵管等组织采自浙江省某暴发鸭瘟蛋鸭场，总核酸提取试剂盒购自罗氏公司，PCR反应试剂购自Takara公司，基因测序所有试剂和耗材购自赛默飞世尔公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物

根据GB/T 22332—2008《鸭病毒性肠炎诊断技术》，合成UL6鉴定基因引物。

1.2.2 DNA提取与PCR扩增

采集病死鸭肝脏、肺脏、十二指肠、输卵管等组织，加入磷酸盐缓冲液(0.01 moL·L-1，pH 7.4)，组织研磨器上匀浆，反复冻融3次后，8 000 r·min-1离心10 min，取上清200 μL，采用罗氏公司总核酸提取试剂盒进行核酸抽提，具体操作过程按照说明书进行，提取的总核酸立即进行PCR反应或冻存于-80 ℃备用。PCR反应体系与程序按照GB/T 22332—2008《鸭病毒性肠炎诊断技术》进行。

1.2.3 序列测定

采用Ion XpressTMPlus Fragment建库试剂盒进行测序文库构建，操作方法按照试剂盒说明书进行。构建好的文库使用Ion S5测序系统和Ion Torrent二代测序平台进行测序。

1.3 分析

采用Torrent server插件将获得的测序原始数据在Ion Torrent平台进行拼接后，于NCBI上进行Blast分析。利用DNAstar软件与GenBank上已发表的鸭瘟病毒的等位同源序列进行对比分析，其中包括CV株(JQ673560.1)、CHv株(JQ647509.1)、VAC株(EU082088.2)、2085株(JF999965)；LH2011株的US10(KC480263.1)、UL2(KC480262.1)、UL12(KC480261.1)、UL41(KC480260.1)、UL47(KC480259.1)；clone-03株的US4-8、US10 (HQ009801.1)、UL12 (EF524094.1)、US10 (EF524095.1)、UL2 (EF449516.1)、gH(DQ227740.1)；strain attenuated strain 1UL2(JQ347517.1)；strain attenuated strain 2UL2(JQ347518.1)。

2 结果与分析

2.1 扩增结果及鉴定

用1.0%琼脂凝胶电泳检测PCR产物，结果在420 bp左右出现目的DNA条带，和预期大小相符。将条带回收，连接至pMD18-T载体，挑取单菌落鉴定后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将测序结果提交至NCBI上进行检索，发现该序列与已发表的鸭瘟UL6基因序列同源性为99%。

2.2 囊膜蛋白分析

通过测序及序列分析，将ZJ2016株囊膜蛋白gK、gN、gC、gB、gH、gM、gL、gG、gJ分别与我国强毒株CHv株、CV株、欧洲强毒株2085株、疫苗株clone-03株及VAC株进行比较。各毒株间氨基酸变化较小，囊膜蛋白的氨基酸同源性均在99%以上(gI除外)，gK、gN、gC、gH、gD的氨基酸序列同源性达到100%。gB、gM、gL、gG、gJ发生个别氨基酸的变化。gI氨基酸变化较多主要是疫苗株VAC在长度及个别氨基酸上的变化明显。gE蛋白的变化主要集中在欧洲株2085与我国毒株的区别(表1)。

2.3 毒力基因分析

2.3.1LORF11基因序列分析

测序结果显示，ZJ2016株鸭瘟病毒LORF11基因编码区大小为4 341 bp。将该序列与数据库中其他毒株比对分析发现，该基因结构出现4种类型(图1)。ZJ2016株与中国分离的强毒株CHv、LH2011、CV株的同源子阅读框结构一致，为A结构类型。LORF11基因分为2个ORF，LORF11A和LORF11B。ZJ2016株、CHv株、CV株中间有861个碱基间隔，而LH2011株则有862个碱基间隔。国外毒株2085株、D11-JW-016株、Jasen株、Hollamd株呈现B结构，与A结构相比，总体序列有1 170 bp的序列缺失，5’端有493 bp的序列与LORF11A序列具有高度同源性，缺失序列间隔后有2 678 bp序列具有高度同源性，其中包含了完整的LORF11B序列。中国疫苗株clone-03中间缺失1 929 bp的序列，两端各有635、1 777 bp的序列分别与LORF11A、LORF11B高度同源，呈现C结构。另一疫苗株VAC则缺失3 513 bp的序列，两端只有647、181 bp的序列具有高度同源性，为D型结构。

ZJ2016株LORF11A氨基端与LH2011同源性最高，达到99.6%，有1个氨基酸发生了改变；与CHv株同源性为98.7%，有2个氨基酸发生了改变。与B结构毒株相比，ZJ2016株与欧洲株2085、D11-JW-016、Jasen株有164个氨基酸完全相同，与Holland株有2个氨基酸不同，分别与疫苗株clone-03、VAC株有211、215个氨基酸同源性100%(图2)。

ZJ2016株LORF11B羧基端与LH2011株、CHv株同源性分别为99.9%和99.1%，与疫苗株clone-03、VAC株分别有563、59个氨基酸同源性100%(图3)。研究发现，LORF11在马立克病毒中与复制机制和毒力密切相关。不同毒株间仍存在个别氨基酸的差异，但这些差异并没有明显的规律。这可能与地方毒株有一定关系，但是否与毒力相关还需要进一步验证。

表1 ZJ2016毒株的囊膜蛋白的氨基酸与其他病毒株的比对结果Table 1 Comparison of amino acids of envelope protein of ZJ2016 strain with other strains

图1 LORF11基因结构类型Fig.1 Gene structure types of LORF11

红色框线为变化氨基酸位置。下图同。The red frame indicated different amino acids. The same as below.图2 LORF11A氨基酸比对结果Fig.2 Amino acid comparison results of LORF11A

2.3.2UL2基因序列分析

UL2基因编码一种尿嘧啶DNA糖基化酶，该酶被证实在HSV的DNA复制中起着重要作用。测序分析结果显示，ZJ2016株UL2编码区全长为1 002 bp，将序列进行Blast比对，各毒株的基因整体结构分为2种类型(图4)。强、弱毒株在氨基酸水平差异明显，主要表现在氨基酸的N端。ZJ2016株与强毒株CHv、CV、国外毒株2085均有100%的核苷酸同源性，基因组结构为E型。疫苗毒株clone-03株、疫苗株VAC株、Attenuated strain 1株、Attenuated strain 2株基因结构均在中间有528 bp的缺失，基因结构为F型。但VAC株在碱基缺失后的序列中比其他序列多出3个碱基，从而出现连续18个氨基酸发生了改变(图5)。这种氨基酸的改变因在强弱毒株中均有出现，因此可能与毒力强弱无关。

2.3.3UL12基因序列分析

UL12基因在HSV-1中编码碱性核酸酶，在HSV-1的复制中起着重要作用[8-9]。ZJ2016株UL12基因氨基酸数量为562个，与CHv株、CV株、LH2011株和欧洲株2085氨基酸同源性为99.8%，仅在385位氨基酸发生了变化，而与疫苗株差异明显。疫苗株clone-03株UL12基因只有446个氨基酸，442～446氨基酸无同源性。VAC株UL12基因包含483个氨基酸，氨基端缺失79个氨基酸(图6)。该结果提示，UL12氨基酸的变化可能导致疫苗毒株的毒力减弱。

2.3.4UL41基因序列分析

UL41基因编码的蛋白为鸭瘟病毒宿主关闭蛋白。研究证实，疱疹病毒的宿主关闭蛋白的作用是极大地增加了细胞质中mRNA降解速度[10-11]。ZJ2016株与CV株及疫苗株VAC、clone-03株氨基酸长度相同，含有498个氨基酸，强毒株CHv株、LH2011株、2085株则含有497个氨基酸，但CHv株与其他2个毒株缺失氨基酸的位置不同。ZJ2016株氨基酸与CV株、CHV株同源性最高，达到99.8%，与其他毒株同源性为99.6%。在第44位氨基酸上，强毒株为谷氨酸，疫苗株为甘氨酸，表明该氨基酸可能与毒株强弱有关。在166(165)位，ZJ2016株与LH2011株、2085株及Clone-03株、VAC株相同。在303(302)位，ZJ2016株、CV株、CHv株、疫苗株相同，LH2011株与欧洲株2085相同(图7)，提示该氨基酸可能与地方株无关。

图3 LORF11B氨基酸结果比对结果Fig.3 Amino acid comparison results of LORF11B

图4 UL2基因结构类型Fig.4 Gene structure types of UL2

图5 UL2氨基酸比对结果Fig.5 Amino acid comparison results of UL2

图6 UL12氨基酸比对结果Fig.6 Amino acid comparison results of UL12

2.3.5UL47基因序列分析

UL47基因编码的蛋白VP13/14是疱疹病毒中最主要的皮层蛋白。研究表明，UL47基因的缺失可导致HSV-1、PRV、MDV病毒滴度的减少，并最终影响病毒复制[12-14]。同时，UL47基因编码的蛋白还被证明参与病毒的体液免疫[15-16]。测序结果(图8)显示，ZJ2016株UL47序列与CHv株序列完全相同，比欧洲强毒株2085和中国强毒株LH2011多出1个氨基酸。氨基酸比对分析发现，在第36位氨基酸上，ZJ2016与3个强毒株一样为丙氨酸，而疫苗株Clone-03与VAC株为缬氨酸，提示该氨基酸可能与病毒毒力相关。在113位、148位、598(599)位，2085株与LH2011株相同，而ZJ2016株则与CHv株和2株弱毒疫苗株完全相同(图8)。

图7 UL41氨基酸比对结果Fig.7 Amino acid comparison results of UL41

图8 UL47氨基酸比对结果Fig.8 Amino acid comparison results of UL47

2.3.6US10基因序列分析

在鸭瘟病毒中，US10是病毒复制的非必需基因[17-19]。疱疹病毒HSV-1的US10基因编码衣壳、皮层相关联的磷酸化蛋白[20]。ZJ2016株的US10序列与强毒株CHv株、CV株、2085株、LH2011株氨基酸长度相同，只在87位发生了由P到Q的变化。与弱毒株相比，氨基酸变化主要发生在C端，整个基因序列多出11个氨基酸，但羧基端有很大不同(图9)，提示可能与毒力相关。

图9 US10氨基酸比对结果Fig.9 Amino acid comparison results of US10

3 讨论

本试验从临床发病的鸭场中分离的病料，经PCR鉴定后确定为鸭瘟病毒。近年来，我国养鸭场中常出现已免疫鸭群发病的情况，疫苗免疫失败的原因可能与疫苗免疫技术、鸭场自身因素及病毒毒株变异导致免疫保护下降等因素相关。

疱疹病毒中，囊膜蛋白是主要的保护性抗原，在病毒的结构、功能和毒力等方面发挥着重要作用。囊膜蛋白序列分析可为鸭瘟的有效防控提供有效线索。本研究中，ZJ2016株囊膜蛋白在氨基酸变化较小，与疫苗株共有5个囊膜蛋白(gK、gN、gC、gH、gD)氨基酸序列同源性达到100%，gB、gM、gL、gG、gJ、gE虽有个别氨基酸发生变化，但同源性都在99%以上。gI蛋白因疫苗株VAC株氨基酸序列长度不同导致与其他毒株同源性较低。陈柳等[21]研究发现，gI基因为鸭瘟病毒的非必需基因，且与病毒的扩散和免疫保护能力相关。比较各强毒株囊膜蛋白基因序列发现，不同毒株间囊膜蛋白基因序列具有高度的保守性。本研究也证明，ZJ2016株并未发生明显变异，免疫失败并非由于流行野毒发生变异所致。

ZJ2016株的LORF11、UL2、UL12、UL41、UL47、US10等基因均与强毒株特征一致。其中，与疫苗株相比，LORF11、UL2、UL12、US10基因发生碱基插入，导致基因结构及氨基酸发生变化，提示这些基因可能与鸭瘟病毒的毒力相关。同时，ZJ2016株在个别基因上也发生了特征性的改变，其变化是否对毒力产生有效影响还需进一步研究。鸭瘟致病机理的研究应重点关注强弱毒株差异基因。

本研究通过基因二代测序技术对获得的鸭瘟病毒毒株进行了测序，分析了囊膜蛋白基因与强弱毒株差异基因的变化。研究结果显示，该场发生的鸭瘟病毒具有强毒株的显著特征，但毒株并未发生明显的变异，目前鸭瘟疫苗仍能提供有效保护，发病原因可能是多种原因导致的免疫失败。