李美霖，陈宇眺，洪晓富，乔宇颖，4，王青霞，陈喜靖，沈阿林，喻 曼，*

(1.浙江农林大学 环境与资源学院，浙江 杭州 311300； 2.浙江省农业科学院 环境资源与土壤肥料研究所，浙江 杭州 310021； 3.浙江省农业科学院 作物与核技术利用研究所，浙江 杭州 310021； 4.西北农林科技大学 资源环境学院，陕西 杨凌 712100)

水稻是我国重要的粮食作物。水稻的生长发育对各种营养元素，尤其是氮、磷、钾的需求量很大。氮素是水稻各生育期所必需的重要元素，被认为是限制水稻产量提升的主要因子。近年来，由于耕地面积不断缩减、生产成本增加，化肥，尤其是氮肥的施用成为了保障水稻单产的关键因素，但由此也导致粮食产量增加和土壤生态保育之间的矛盾日渐突出[1]。不合理的氮肥施用对土壤结构和肥力造成了不同程度的破坏，并引发一系列的环境问题。已有研究表明，在田间管理中，优化稻田氮肥管理模式是弱化这一矛盾的重要措施。适当调整氮肥施入量和施入时间不仅能促进水稻对氮素的吸收利用，还能促进稻田氮素转化，减少农田氮肥施用可能带来的负面环境影响。目前，关于稻田氮肥管理的研究主要聚集于对水稻生长发育和氮肥利用率的影响方面，对稻田生态系统影响机理的研究较少[2-4]。土壤微生物作为土壤生态系统的重要角色，对土壤生态环境的变化过程极其敏感。土壤生态环境的变化影响土壤微生物群落和结构的动态变化，而土壤微生物群落结构和功能的改变也可以反映外界环境的变化，具有指示作用[5-6]。本研究综合运用Biolog-Eco微平板法和磷脂脂肪酸(PLFA)法综合分析不同氮肥管理模式下稻田土壤微生物群落结构、总体活性和代谢功能的变化，旨在为稻田合理施用氮肥提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2018年在衢州市衢江区莲花镇的大田(118°93′E，28°98′N)开展。该地区属中亚热带季风气候，温和湿润，四季分明，具有春早、秋短、夏冬长的特点。全年日照时数为1 785～2 118 h，年无霜期为224～246 d，年平均气温为15.5～16.0 ℃，全年最高气温出现在7月，平均气温达29.1 ℃，最冷月份为1月，平均气温为5.2 ℃。当地雨量充沛，年降水量为1 542～1 763 mm，年均降水日为142～155 d，降水多集中在4至6月份[7]。

1.2 试验设置

试验小区按完全随机区组方式排布，共设置4个处理(表1)，分别为：不施氮肥(CK)，农民习惯施肥(FP)，氮肥优化管理1(OPT1)，氮肥优化管理2(OPT2)。各处理除N素投入量不同外，P2O5、K2O的投入量相等。每个处理设置3次重复，小区面积27 m2(5.0 m×5.4 m)。

供试品种为甬优538(籼粳杂交稻)。播种日期为5月23日；移栽日期为6月21日，秧龄29 d；收获日期为10月10日。田间水分管理、病虫害防治同生产实际。

供试复合肥中N、P2O5、K2O的质量分数分别为15%、15%、15%，缓释肥中N、P2O5、K2O的质量分数分别为46%、16%、26%，尿素中N的质量分数为46%，过磷酸钙[Ca(H2PO4)2]中P2O5的质量分数为16.7%，KCl中K2O的质量分数为60%。

水稻收获后采用5点法取0～20 cm耕层的土壤，然后混合均匀。

1.3 指标测定

1.3.1 Biolog-Eco微平板法

Biolog-Eco微平板法(Biolog-EcoPlateTM)通过记录各板孔在规定时间特定波长吸光值的变化来反映微生物群落的代谢活性和功能多样性[8]。Biolog-Eco板共96孔，分为3个平行，每个平行32个孔。孔中含有营养盐和四唑盐染料TTC，其中1孔不含碳源为对照孔，其他31孔含有不同的单一碳源，微生物对碳源的利用程度可由Biolog-Eco板中每个孔的颜色反映[9]。Biolog-Eco板所用接种液的制备采用Classen等[10]的方法：称取相当于5 g干土质量的鲜土加入到已经灭菌的锥形瓶中，加入45 mL无菌水，在摇床上振荡30 min，转速为180 r·min-1，静置后吸取1 mL悬浮液离心20 min，弃去上清液，加入1 mL质量分数为0.85%的生理盐水，在摇床上振荡5 min，重复3次，取0.5 mL上清液用质量分数为0.85%的生理盐水稀释到Biolog系统所要求的接种浓度，将稀释后的溶液接种到Biolog-Eco板上，每孔加样量为150 μL，将接种好的微平板置于25 ℃的恒温培养箱中避光培养，分别于24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h在590 nm处读取吸光值[10]。

表1 不同处理的施肥管理方案Table 1 Different treatments for fertilization management

1.3.2 PLFA法

土壤总脂质的提取参考Yu等[11]的方法：称取3 g新鲜土壤样品装入30 mL玻璃离心管中，加入提取液(磷酸缓冲液、甲醇、氯仿体积比0.8∶2∶1混合而成)提取总脂质，然后通过硅胶柱(Waters，500 mg，100～200目)层析分离出PLFA，加入内标十九烷酸(C19:0)进行甲酯化反应，最后通过气相色谱(GC)(Agilent 6890)分离检测PLFA。根据Sherlock MIS 4.5系统(Sherlock Microbial Identification System)报告和相关文献对PLFA进行定性分析，根据内标物进行定量计算。以PLFA总量来估算土壤样品的微生物生物量[12]。以指示PLFA估算相应指示群落的生物量，指示细菌的脂肪酸有i15:0(好氧细菌)、a15:0(好氧细菌)、15:0、i16:0、16:1ω5(甲烷氧化菌)、16:1ω7t、i17:0、a17:0、cy17:0、17:0(节杆菌属)、18:1ω7(假单胞杆菌)、18:1ω7t、18:1ω5(厌氧菌)、i19:0、a19:0、cy19:0；指示真菌的脂肪酸有18:1ω9、18:2ω6、18:3ω6、18:3ω3；指示放线菌的脂肪酸有10Me16:0(硫酸盐还原细菌)、10Me17:0、10Me18:0。

1.4 数据处理

土壤微生物群落的代谢活性用31孔的平均吸光值(AWCD)来描述。

采用Biolog-Eco微平板培养120 h的吸光值来计算微生物群落结构的代谢功能多样性指数——Shannon-Wiener指数(H)、Simpson指数(C)和Pielou均匀度指数(J)。其中，Shannon-Wiener指数和Simpson指数用于评价和比较微生物群落的多样性；Pielou均匀度指数用于评价各物种个体数目分配的均匀程度[13-14]。

用Excel 2010进行数据处理，用Canoco 4.5进行主成分分析(PCA)，用Sigma plot 12.5进行分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 不同施肥管理模式下土壤微生物的碳源利用特征

各处理的AWCD值随时间的变化能直观地体现微生物群落的反应活性和最终达到的程度[9]。如图1所示，各处理的AWCD值在开始时均较低，说明其土壤微生物代谢活性均较低，24 h后随着培养时间延长，土壤微生物的代谢活性逐渐增强，不同处理间出现明显差异，192 h后趋于平稳并达到最高值，各处理的AWCD值从大到小依次为OPT1>CK>FP>OPT2。

图1 不同处理土壤微生物群落AWCD值随时间的动态变化Fig.1 Dynamics of AWCD value of soil microbial communities under different treatments

根据Biolog-Eco板上31种碳源的化学基团性质，可将其分为6大类碳源[13]：10种属碳水化合物类，6种属氨基酸类，4种属聚合物类，2种属胺类，2种属酚酸类，7种属羧酸类。不同处理下各碳源占总碳源的比例如图2所示。可以看出，碳水化合物类、氨基酸类、聚合物类和羧酸类是微生物主要利用的碳源。CK和OPT1处理的土壤微生物对6类碳源均有利用，OPT1处理的土壤微生物对胺类和酚酸类的利用占比大于CK，但对碳水化合物类和羧酸类的利用占比小于CK；

图2 不同处理的土壤微生物AWCD值占比Fig.2 Proportion of AWCD value of soil microbes under different treatments

FP处理的土壤微生物未利用胺类碳源，对酚酸类和羧酸类的利用占比均高于CK，但对氨基酸类的利用占比小于CK；OPT2处理的土壤微生物只利用了4类碳源，对碳水化合物类的利用占比小于CK，但对氨基酸类、聚合物类和羧酸类的利用占比均高于CK。结果表明，不同施肥管理模式对土壤微生物群落结构有影响，各组处理的土壤微生物群落结构存在差异，且OPT1处理与OPT2处理的差异明显。

2.2 不同施肥管理模式下土壤微生物的碳源利用多样性

如表2所示，各处理的Simpson指数差异不显著，而Shannon-Wiener指数和Pielou均匀度指数存在显著(P<0.05)差异，表明不同施肥管理模式对土壤微生物群落多样性和物种个体分布均匀度具有显著影响。OPT1处理的土壤微生物群落多样性和物种均匀度均最高，CK和FP处理的土壤微生物多样性和物种均匀度相近，OPT2处理的土壤微生物多样性和物种均匀度最低。OPT1处理显著(P<0.05)提高了土壤原有的微生物多样性和物种个体分布的均匀度，而OPT2处理则对土壤微生物多样性和物种个体分布均匀度有一定的抑制作用。

2.3 不同施肥管理模式下土壤微生物的群落结构变化

各处理的PLFA微生物生物量和真菌-细菌比(F/B)如图3所示。各处理的细菌含量明显高于其他微生物菌群，且真菌含量高于放线菌含量，表明细菌是本试验条件下水稻土中的优势菌群。OPT1处理的总PLFA含量最高，为42.11 nmol·g-1，CK和OPT2处理分别为34.19 nmol·g-1

表2 不同处理的土壤微生物多样性分析Table 2 Analysis of soil microbial diversity under different treatments

同列数据后无相同小写字母的表示处理间差异显著(P<0.05)。
Data marked without the same letters indicated significant difference atP<0.05 in the same column.

图3 不同处理的土壤PLFA微生物群落含量及F/BFig.3 Microbial content and F/B of PLFA under different treatments

和40.16 nmol·g-1，FP处理最低，为34.16 nmol·g-1。OPT1和OPT2处理的细菌、真菌和放线菌PLFA含量均高于其他处理，说明合适的氮肥优化管理处理的PLFA总量高于常规施肥处理，合理减施氮肥能增加土壤微生物生物量。各组之间F/B差异较小，表明短期内不同施肥管理措施对土壤微生物群落结构的影响不显著。但是，不同处理对微生物总生物量的影响显著(P<0.05)。

2.4 不同施肥管理模式下土壤微生物的信息主成分分析

以4种处理培养120 h的AWCD值为依据，对其碳源利用能力进行主成分分析。如图4-A所示，PC1的贡献率为64.09%，PC2的贡献率为17.99%。PC1中羧酸类、氨基酸类和碳水化合物类利用所占的权重较高，PC2中酚酸类和胺类利用所占的权重较高。样本间距离越近，表明样本相似程度越高，反之亦然[15]。各处理在PC轴上出现了明显的分异，且距离较远，表明各处理的土壤微生物在碳源代谢能力上存在显著(P<0.05)差异，FP和OPT2处理相较于CK处理的土壤微生物群落结构差异较大，OPT1处理相较于CK处理的土壤微生物群落结构差异较小。

图4 基于不同处理土壤微生物Biolog(A)和PLFA(B)的PCA分析Fig.4 PCA based on soil microbial Biolog (A) and PLFA (B)

各处理PLFA数据的PCA结果如图4-B所示，PC1和PC2的总贡献率为91.8%，合起来基本可以反映土壤微生物的群落结构特征。CK与FP均位于第四象限，OPT1、OPT2分别位于第二、三象限。PLFA单体集中在PC1负半轴，又以OPT1所在象限居多，表明OPT1与OPT2中微生物信息在PCA载荷图上起主导作用，同时这2种模式的土壤微生物群落结构存在一定差异。OPT1的土壤微生物群落与a17:0、cy17:0、18:2ω6、16:1ω5、和a15:0距离较近，说明在OPT1处理中真菌、甲烷氧化菌和好氧细菌起主导作用；OPT2离10Me17:0、18:1ω5、18:1ω7和16:1ω7较近，说明放线菌、厌氧细菌和假单胞杆菌在OPT2中起主导作用。

3 讨论与结论

土壤微生物是由多个种群组成的微生物群落，不同种群之间存在着共生、互利、共存、竞争等各种复杂的关系，共同在土壤物质循环和能量转化过程中发挥着重要作用。研究微生物群落结构及其代谢功能，可以揭示土壤生态环境变化的生物学基础，提供评价和预测土壤生态环境安全性的基本信息[9]。本试验测定结果显示，Biolog-Eco微平板法和PLFA方法的分析结果存在一定差异，这可能是由于其方法原理不同导致：PLFA方法通过分析微生物细胞膜磷脂脂肪酸的含量来反映微生物群落结构[16]；而Biolog-Eco微平板法则是通过分析微生物对不同碳源的利用能力来获得有关微生物群落总体活性与代谢功能的信息[9]。

施肥对土壤微生物群落的影响存在一定的不确定性，但众多研究表明，合理的施肥管理模式更有利于提高土壤微生物群落的多样性和总生物量。李清华等[17]研究表明，黄泥田合理施肥可显著提高土壤微生物群落数量与含量；而白震等[18]研究发现，长期氮磷肥配施或氮磷钾肥配施抑制了黑土土壤中大多数菌群的生长；但颜慧等[19]研究认为，施用氮磷钾肥显著提高了红壤土壤微生物总PLFA，以及细菌和放线菌PLFA含量。本研究中，氮肥优化管理模式下微生物的总PLFA，以及细菌、真菌和放线菌含量均较高，由此观之，优化氮肥管理处理的施肥方式更为合理。

土壤微生物的群落结构易受土壤养分和地上部作物的共同影响。植物在环境养分胁迫时，体内会合成特定的根系分泌物，以提高其对养分的吸收利用能力。Liljeroth等[20]研究认为，氮对土壤微生物群落结构的影响是通过改变根系分泌物间接实现的。崔佩佩等[21]研究发现，缺氮胁迫提高了高粱根际微生物的代谢活性，增强了其对氨基酸类、羧酸类、胺类、糖类和聚合物类的利用能力，但降低了对双亲化合物的利用，缺氮胁迫下高粱根际土壤微生物的种类和优势度指数明显高于其他处理。酚酸类作为Biolog-Eco板中添加的碳源之一，在土壤中多是作物化感作用通过根际释放到土壤环境中的次生代谢产物，对抑制伴生杂草有作用[22]。稻田土壤中的酚酸主要是在水稻生长过程中释放到环境中的，水稻收获后，土壤中酚酸的主要来源被切断，而原有的酚酸被微生物利用降解，致使土壤中的酚酸含量迅速降低[23]。本研究中，OPT1和OPT2处理均提高了微生物代谢活性及其对氨基酸类、羧酸类、胺类、糖类和聚合物类碳源的利用能力，表明氮肥优化处理可能通过一定的缺氮胁迫刺激作物根系发育，从而促进其对养分的吸收利用。OPT1处理的土壤微生物对酚酸类碳源的利用能力高于其他处理，表明该处理土壤中酚酸含量可能较高，这对后期稻田杂草可起到一定的抑制作用，有利于维持稻田健康发展。

一般认为，真菌与细菌比值越高，表明农田土壤生态系统越稳定。真菌的化学成分较复杂，其贮存源碳量是细菌的26倍，通过真菌生物量固定的碳比细菌生物量固定的碳更稳定持续。此外，真菌具有菌丝，可以运动、寄居并迅速降解土壤表面的动、植物残体，有利于有机质积累[18]。甲烷氧化菌以甲烷为唯一碳源。土壤中甲烷氧化菌的氧化作用可将土壤中的部分甲烷氧化，减少甲烷排放量，同时增加土壤氮素含量。有研究表明，甲烷氧化菌对土壤甲烷的消耗约占大气甲烷消耗量的10%[24]。放线菌大部分为好氧菌，少部分为厌氧菌，假单胞杆菌严格好氧。水稻收获后，土壤含水率下降，孔隙度较大，含氧量上升，浅层土壤微生物群落中好氧微生物成为优势菌群。本试验中，OPT1与OPT2处理均施入缓释肥，二者的差异仅在于缓释肥的施用时间不同。OPT1模式的土壤微生物多样性和总生物量均高于OPT2，且微生物物种个体的分布均匀度大。真菌、甲烷氧化菌和好氧细菌在OPT1处理的土壤微生物中起主导作用，而放线菌、厌氧细菌和假单胞杆菌在OPT2处理的土壤微生物中起主导作用。OPT1的F/B值最高，说明与OPT2处理相比，OPT1处理的土壤含氧量较高，土壤微生物多样性较复杂，土壤养分积累较高。由此可见，缓释肥的施入时间对土壤微生物多样性和物种个体均匀度影响显著。水稻是喜铵性作物，但是其不同生育期对铵态氮、硝态氮的相对吸收量和比例不同。缓释肥可协调作物养分的供给，使养分在土壤中缓慢释放，减少养分的损失，肥效期长且稳定，能源源不断地供给作物在整个生育期所需的养分[25-26]。郑圣先等[27]研究认为，缓控释肥料供给养分的释放速度基本能与水稻生长发育的需求同步，促进了水稻氮素的吸收，提高了氮素利用效率，从而可达到增产效果。周波等[28]研究表明，施用缓释尿素可提高氮肥利用率，且减肥效果明显，有益于生态环境保护。杨斌华等[29]研究表明，高分子缓控释化肥在细菌微生物的作用下有80 d的缓释放周期，养分释放率达到98%，说明缓释肥有其特定的缓释时间，因此施入田间的时间至关重要。本试验中，缓释肥作为基肥施入稻田与水稻的需肥规律更匹配，能够有效提高肥料利用率，同时也更有利于提高微生物群落多样性，进而促进土壤生态环境稳定。

综上所述，不同氮肥管理方式对水稻土壤微生物群落结构的影响不同。本研究中的农民习惯施肥管理模式降低了土壤微生物含量，微生物代谢活性较弱，利用碳源种类较少；氮肥优化管理1显著增强了土壤微生物的代谢活性和利用碳源的能力，微生物总含量和种类均增加；氮肥优化管理2降低了微生物代谢活性，抑制了微生物的生长，不利于各种类微生物的均衡发展。在本试验条件下，将450 kg·hm-2复合肥、75 kg·hm-2缓释肥、42.5 kg·hm-2KCl和197.5 kg·hm-2Ca(H2PO4)2一起作为基肥施入稻田，分蘖期时施入150 kg·hm-2尿素，孕穗期时施入300 kg·hm-2复合肥的氮肥管理模式更利于实现稻田土壤微生物群落结构多样性的稳定发展，该结果可为当地化肥减施提供一定的理论基础。