尹超云， 张 垚，陈振威，张安伟，张旋风，张日亭，步雪峰

(1.江苏大学附属医院 血管外科， 江苏 镇江 212000； 2.江苏大学 医学院，江苏 镇江 212013； 3.江苏大学附属人民医院 普外科， 江苏 镇江 212002)

胃癌(gastric cancer)是中国常见的消化道肿瘤之一，居于第2位[1]。肿瘤的转移是影响肿瘤预后重要的原因之一，而肿瘤细胞的增殖与迁移能力是肿瘤细胞转移的关键环节。IFN λ 家族是一组新型人白细胞介素(interleukin，IL)，又名Ⅲ型 IFN，包 括 IL-29 (IFN-λ1)、IL-28A(IFN-λ2) 和 IL-28B(IFN-λ3)，具有抗增殖、抗肿瘤以及免疫调节等生物学活性[2]。有研究表明，表达IL-29 的重组新城疫病毒LoSota 株(recombinant Newcastle disease virus LoSota strain expressing IL-29， rL-IL29) 抑制肺腺癌A549 细胞的增殖及迁移与AKT途径有关[3]，对于IL-29 是否能抑制胃癌细胞增殖与迁移尚不清楚。在多种癌细胞中发现ERK(extracellular signal regulated kinase,ERK)的被异常激活，是肿瘤发生的重要因素之一。研究表明胃癌患者血清中磷酸化ERK蛋白水平升高，且随着胃癌分期的增加其表达量也增加[4]。同时ERK与AKT在肿瘤转移的通路中具有重要的作用。本实验探讨IL-29对胃癌BGC细胞增殖和迁移的影响及其相关机制。

1 材料与方法：

1.1 材料

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV) (哈尔滨兽医研究所)；rL-IL29(本实验组构建)；人胃癌细胞系BGC(中国科学院上海生科院细胞资源中心)；RPMI 1640培养基(Gibco公司)，胎牛血清(维森特生物技术南京公司)；兔抗IL-29、MMP2(72、66 ku)、p-AKT抗体(美国博士德生物公司)；兔抗P-ERK1/2、HRP标记的抗鸡(Abbkine公司)；HRP标记羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(均上海康为世纪公司)；Alexa Flour 488标记羊抗鼠IgG、Cy3标记羊抗鼠IgG(KLP公司)；CCK-8试剂盒(南京厚载生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理:将BGC细胞置于37 ℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中，用含10%胎牛血清的RPMI 1640(加100 U/mL青-链霉素)培养。取对数增殖的BGC细胞随机种于6孔板内，培养24 h，待BGC细胞覆盖6孔板孔80%左右时将6孔板随机分为PBS组(即对照组)、rL-IL29组及NDV组。用1640培养基将IL-29及NDV稀释至10 000倍感染6孔板内BGC细胞，培养24 h后为下一步实验做准备，每组样本重复3次。

1.2.2 CCK8法检测BGC细胞活力：在96孔板每孔中加入BGC细胞悬液100 μL (约5 000～10 000个细胞)，边缘孔用PBS填充，在恒温培养箱中孵育12 h。将IL-29及NDV病毒稀释倍数为为原液的10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，每孔加入上述浓度10 μL的稀释病毒液，培养箱孵育24 h。再在每孔加入10 μL CCK-8溶液，培养箱孵育4 h。设置无胃癌细胞的空白孔(培养基和CCK-8溶液)，有胃癌细胞的对照孔(不加培养基和CCK-8溶液)，每组设定3个复孔。测定450 nm各孔的吸光度值。细胞活力=(实验组a-空白组a)/(对照组a-空白组a)

1.2.3 病毒滴度测定: 将细胞增殖状态良好的BGC 细胞消化计数后稀释至1×105个/mL，加入96孔板，100 μL/孔(37 ℃，5% CO2)，培养 24 h 后加病毒。在1.5 mL离心管中，设置6个稀释度，第一管加90 μL培养液，然后加入10 μL病毒原液，混匀后吸取10 μL加入第2个离心管中，以此类推，培养24 h后观察其死亡(或阳性)数，然后计算出各稀释点引起死亡累积数的死亡率。所求得的值就写为EID50。其算法为:lgEID50=高于 50%死亡的稀释倍数的对数+稀释系数的对数×距离比距离比=(高于50%的死亡率-50%) /(高于50%的死亡率-低于50%的死亡率)

1.2.4 克隆形成实验检测细胞增殖：将6孔板孔分为对照组、IL-29 组及NDV 组细胞，按每孔1 500 个细胞的标准接种对数增殖的BGC细胞， 每组设立3 个复孔。培养24 h 后予以换液，每隔2～3 d 换1 次培养基，培养10 d后，结晶紫染液进行染色，计数并拍照。按公式计算: 克隆形成率(%)=(克隆数/接种细胞数)×100%(以50个细胞以上为一个集落)。

1.2.5 Western blot检测IL-29、NDV、MMP2、p-ERK和p-AKT蛋白：将1.2.1中准备好的6孔板里的细胞提取蛋白。进行SDS-PAGE电泳，再转膜，5% BSA封闭1 h，分别加入鸡抗NDV蛋白抗体(1∶800)、兔抗IL-29、MMP2、p-AKT(1∶300)、兔抗P-ERK(1∶400)及β-肌动蛋白抗体(1∶2 000)，4 ℃孵育过夜。加入羊抗鼠或羊抗兔或羊抗鸡 HRP-IgG(1∶2 000)室温孵育1 h，TBST洗膜，ECL显色扫描，LANE.1D软件进行条带吸光度值定量分析。

1.2.6 免疫荧光检测p-ERK的表达： 24孔板内对数增殖的BGC细胞经病毒处理培养24 h 后，在室温下经4%多聚甲醛固定4 h，PBS洗3次，0.5% Triton×100室温下处理细胞30 min，PBS洗3次，经5% BSA封闭1 h，p-ERK一抗4 ℃孵育过夜。PBS洗3次，Cy3标记的兔二抗(1：200)染色1 h，PBS洗3次；Hoechst 33342 染色细胞核10 min，PBS洗3次后置于荧光显微镜下观察。

1.2.7 Transwell小室法检测细胞侵袭：用无血清 DMEM 配制成约1×105个/mL的BGC细胞悬液，取 200 μL滴入24孔板Transwell小室的上室，下室分别加入含10%胎牛血清的1640培养基稀释的PBS(对照组)、NDV及rL-IL29(1∶1 000)各500 μL，每组均设立2个复孔，37 ℃、5% CO2的培养箱内培育 24 h。用棉签擦去 Transwell 上室聚碳酸酯膜表面的细胞，PBS洗2遍，将上室置于4%多聚甲醛中固定15min。PBS洗2遍后，结晶紫染色20 min，再用PBS洗2遍后，倒置相差显微镜下计数10个不同视野的细胞数，计算平均值。

1.2.8 划痕实验检测细胞迁移：24孔板中的BGC细胞用含10%胎牛血清的1640 培养基进行培育，待细胞覆盖率达80% ～ 90% 时，用无菌10 μL 的加样枪头在细胞层中缓缓的纵向划一条直线，同时保持划痕的宽度均匀一致; 再用PBS 洗3遍，用1640培养基将病毒rL-IL29、NDV分别稀释到10 000倍，将稀释后rL-IL29、NDV病毒稀释液加入到24孔板中作为rL-IL29组和NDV组，同时用1640培养基作为对照组。分别于划痕后0、24 h 在倒置显微镜下观察划痕间距。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 CCK8检测病毒对BGC活力的影响

随着病毒的稀释倍数降低时，胃癌细胞的活力降低，当病毒稀释液浓度为10-2、10-3时细胞活力<80%。选用细胞活力>80%时的滴度[5]，故后续实验病毒稀释液选择10-4作为后续实验的工作浓度，此时La Sota系NDV病毒液及rL-IL29 病毒液的滴度都在鸡胚半数感染量 (50% egg infective doses，EID50) 为109.8 EID 50 /mL左右(P<0.05)(图1)。

*P<0.05 compared with the NDV group图1 不同浓度的rL-IL29及NDV病毒对BGC胃癌细胞活力的影响Fig 1 Effects of different concentrations of rL-IL29 and NDV viruses on the cell vitality in gastric cell

2.2 克隆形成实验检测rL-IL29感染对BGC细胞增殖的影响

将两种稀释后的病毒感染胃癌细胞BGC培养10 d 后，rL-IL29、NDV病毒抑制了胃癌细胞BGC的增殖，同时rL-IL29组的胃癌细胞较NDV及PBS组受到明显的抑制 (P<0.05)(图2)。

2.3 NDV、IL-29、p-ERK、MMP2和pAKT蛋白的表达

NDV蛋白在rL-IL29 组及NDV组稳定表达，rL-IL29组的 IL-29 蛋白表达较NDV 组及PBS组明显升高(P<0.05)，p-ERK蛋白在rL-IL29组、NDV组的相对表达量较PBS组明显降低(P<0.05)，且rL-IL29组的p-ERK蛋白表达量低于NDV组(P<0.05)；MMP2及pAKT得到了相似的结论(图3)。

*P<0.05 compared with the PBS group；#P<0.05 compared with the NDV group图2 rL-IL29 感染对BGC细胞增殖的影响Fig 2 Effect of rL-IL29 infection on proliferation in gastric cell line

*P<0.05 compared with the PBS group；#P<0.05 compared with the NDV group图3 感染 rL-IL29 后对 BGC 细胞迁移相关蛋白的影响Fig 3 Effect of rL-IL29 on the migration-related protein in gastric cell line

2.4 P-ERK的免疫荧光检测

P-ERK蛋白在rL-IL29组的蛋白表达量明显低于NDV组及PBS组(P<0.05)，p-ERK蛋白在NDV组的蛋白表达量明显低于PBS组(P<0.05)(图4)。

2.5 rL-IL29 抑制 BGC 胃癌细胞侵袭能力：

rL-IL29 组穿过Transwell 小室的胃癌细胞数明显少于 NDV 组及 PBS组(P<0.05)，NDV 组的胃癌细胞穿过 Transwell 小室的细胞数明显少于 PBS 组(P<0.05) (图5)。

2.6 rL-IL29 抑制BGC细胞的迁移能力

48 h 后rL-IL29 组 BGC 细胞的迁移距离明显低于 NDV 组和 PBS 组，NDV 组 BGC 细胞的迁移距离明显低于 PBS组 (P<0.05)(图6)。

3 讨论

新城疫病毒(NDV) 具有很好的溶瘤作用且对人的致病性极低，可以促进 NK 细胞产生IFN-γ从而上调 NK 细胞 TRAIL 蛋白表达，致使肿瘤细胞的凋亡与坏死[6]。 IL-29 在人体多种细胞中均有表达，同时它的活性最强， IL-29 通过与 IL-28R1 结合发挥生物学效应[7]。IFN λ 可以明显抑制鼠的皮下瘤肺转移的作用[8]。本实验结果表明，在rL-IL29转染BGC胃癌细胞24H后，IL-29 蛋白表达明显高于其他组，可以表明rL-IL29稳定表达IL-29。 同时从细胞克隆实验、细胞划痕实验及Transwel可以看出rL-IL29明显抑制了胃癌细胞的增殖与迁移作用，且 rL-IL29的抑制效果较 NDV更明显。

ERK是一类丝/苏氨酸激酶，在细胞的增殖、迁移、分化和凋亡等多种过程发挥了重要作用，当受到细胞外信号刺激时，可激活ERK信号传导通路，参与了细胞外信号传入细胞内的经典途径[9]。有研究表明异常激活的磷酸化的ERK在胃癌、肺癌等多种恶性肿瘤中均能发现，同时ERK通路也涉及恶性肿瘤的发生、发展及恶化过程[10]。本研究中rL-IL29组ERK蛋白磷酸化水平(p-ERK)较NDV组及PBS组下调，说明rL-IL29可以下调p-ERK从而抑制了ERK的信号传导通路。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs) 是一类细胞外蛋白水解酶，可以将细胞外基质中的各种蛋白成分降解[11]。MMP2 作为其家族中的一员，在基底膜的降解以及肿瘤细胞迁移、浸润中起着至关重要的作用[12]，MMP2 表达强度与胃癌分期、淋巴结转移呈正相关[13]。AKT 是 PI3K/AKT信号通路中的原癌基因，PDK1可以激活PI3K/AKT， 活化的 AKT可以调节其下游的多条通路，从而促进细胞增殖、抗凋亡以及迁移[14]。本实验中发现rL-IL29可以下调MMP2和p-AKT的水平，从而进一步证明rL-IL29可以抑制BGC胃癌细胞的迁移，同时也表明rL-IL29的抑制肿瘤细胞的机制与下调MMP2和p-AKT蛋白有关。

*P<0.05 compared with the PBS group；#P<0.05 compared with the NDV group图4 感染 rL-IL29 后对 BGC 细胞p-ERK蛋白的影响Fig 4 Effect of rL-IL29 on p-erk protein in gastric cell line

*P<0.05 compared with the PBS group；#P<0.05 compared with the NDV group图5 感染 rL-IL29 后对 BGC 细胞侵袭性的影响Fig 5 Effect of rL-IL29 infection on the invasiveness in gastric cell line

*P<0.05 compared with the PBS group；#P<0.05 compared with the NDV group图6 感染 rL-IL29 后对 BGC 细胞迁移的影响Fig 6 Effect of rL-IL29 infection on migration in gastric cell line

综上，本研究表明 rL-IL29 可能通过阻碍ERK, PI3K /Akt信号通路，下调MMP2蛋白的表达，从而抑制 BGC胃癌细胞的增殖与迁移，但两条通路的具体的作用机制仍需进一步研究。