邱奕雁，郑羽晨，郭伟壮，周文钰，颜 滨， 杨欣建

(1.深圳市第二人民医院 骨科, 广东 深圳 518000； 2.南方医科大学第三附属医院 骨科, 广东 广州 510630)

骨质疏松(osteoporosis, OP)是一种骨骼重构不平衡导致的系统性骨骼疾病，主要表现为全身性骨量减少、骨组织微细结构被破坏、骨脆性增加和易于骨折。国际临床调查研究显示，50岁以上中老年女性骨质疏松症的患病率为6%，而80岁以上老年女性的患病率高达50%[1]。中国部分地区中老年人群骨质疏松症流行病学研究结果显示，40岁以上人口的骨质疏松患病率为16.1%，随年龄增加，骨质疏松发生率递增，60岁以上人群为22.6%，超过80岁时达到50%[2]。

目前，骨质疏松治疗药物的主要选择包括抗骨吸收药物，如二磷酸盐、降钙素[1]、雌激素或者其类似物[2]、破骨酶K的抑制剂奥当卡替、胰高血糖素样肽2等[3]。上述药物的主要作用在于减缓骨质吸收，但是对于骨量的增加作用有限[4]。目前显著增加骨量且对骨质疏松起到显著逆转作用的药物只有甲状旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)[3]。共转录因子CITED(CBP/p300 interacting transactivator with Glu/Asp rich carboxy-terminal domain, CITED)为一核蛋白家族，其中CITED1、CITED2和CITED4表达在哺乳动物细胞中，均可参与调控不同的CBP/p300依赖的转录反应。最近研究表明，CITED1在成骨细胞中亦有表达[5]，但其对骨代谢的具体影响尤其是对在体骨代谢的影响尚不知道[4]。本研究拟构建CITED1基因敲除的小鼠模型，观察野生型(wild type,WT)小鼠和CITED1敲除(conventionai knockout,KO)小鼠在骨组织内骨骼动态平衡的过程，比较成骨细胞与破骨细胞血液骨代谢标志物，分析CITED1在成骨/破骨平衡中的调节作用，在体研究CITED1在调节骨代谢中的作用，为骨质疏松的治疗提供相应的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞总RNA抽提试剂Trizol和M-MLV反转录试剂盒(Invitrogen公司)；蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich公司)；PVDF膜(Millipore公司)；I型原胶原肽(procollagen I peptide, P1NP)、骨钙素(osteocalcin, OC)、骨碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase, BALP)以及抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)检测试剂盒(上海煊翎生物科技有限公司)。Real-time PCR所使用的引物(上海杰李生物有限公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 CITED1基因敲除小鼠的培养和繁殖：CITED1基因敲除小鼠(KO小鼠)在南京模式动物中心构建，小鼠采用野生型C57BL/6小鼠(WT小鼠)小鼠背景繁殖，小鼠饲养在SPF级动物房中，小鼠可任意进食及饮水(SPF级动物房提供的标准食物)。动物房保持温度(22±3)℃，湿度35%±5%，12 h昼夜周期(早上6∶30亮灯)。所有实验均使用8～16周龄雄鼠。小鼠处死之前均预先用戊巴比妥钠麻醉，所有小鼠实验操作均通过医院动物伦理委员会的审核(批准文号：002019-3-12)。

1.2.2 酶联免疫吸附法检测骨代谢的血液学相关指标：5周龄雄性KO小鼠和WT小鼠各8只，采用酶联免疫吸附法检测检测外周血血清中I型原胶原肽(type I procollagen peptide，P1NP)、骨钙素(osteocalcin，OC)、骨碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BALP)以及抗酒石酸酸性磷酸酶(tartaric acid phosphatase，TRAP)的浓度。P1NP、OC、BALP以及TRAP的检测根据试剂盒说明书进行。

1.2.3 直接测量法测量小鼠股骨长度：采用直接测量的方法取1日龄雄性KO小鼠和WT小鼠各8只，取出小鼠股骨并用游标卡尺测量小鼠的股骨长度，记录并统计。

1.2.4 显微电子计算机断层扫描(computed to-mography,CT)定量检测KO小鼠骨量和骨皮质以及骨松质厚度：取5周龄雄性KO小鼠和WT小鼠各8只，检测小鼠的骨代谢表型。动物麻醉后取小鼠股骨，然后用4%甲醛固定液固定至少24 h后，显微CT定量测量皮质骨、松质骨的厚度和骨量。

1.2.5 胰蛋白酶消化法提取KO小鼠颅骨成骨细胞：用1日龄KO小鼠，75%乙醇浸泡消毒后取出小鼠头盖骨，先用0.25%胰蛋白酶消化去除表面结缔组织，再用PBS清洗后将头盖骨剪碎，用0.1% Ⅱ型胶原酶37 ℃培养箱中振荡消化50 min，用血清终止法终止胶原酶的消化作用。反复吹打混匀细胞混悬液，然后通过220目网筛过滤去掉杂质，PBS洗涤3次，最后1 000 r/min离心10 min沉淀细胞，将细胞置于直径6 cm培养皿中传代培养4代后纯化成骨细胞，用于后续检测。

1.2.6 Western blot检测小鼠颅骨成骨细胞的敲除效果：用RIPA裂解纯化成骨细胞，12 000 r/min离心20 min，去上清进行蛋白浓度测定，再用6 ×上样缓冲液制样。上样90 V恒压电泳，然后以400 mA恒流将蛋白电转到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭PVDF膜1 h。封闭结束后，在含5% BSA的TBST中的一抗4 ℃过夜，二抗室温结合2 h，加入显影液曝光显影。

1.2.7 RT-qPCR检测骨标志基因的表达：用Trizol提取纯化培养的新生小鼠颅骨成骨细胞的总RNA具体步骤：Trizol室温裂解细胞，氯仿分离去除蛋白，取水相加入异丙醇萃取RNA沉淀，用75%乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀，晾干残留乙醇，将沉淀溶于适量DEPC水中，检测RNA纯度及浓度。用M-MLV反转录系统进行反转录，得到cDNA。使用Applied Biosystems公司的SYBR Green PCR system，以actin为内参，进行基因的实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测。

所使用的引物如下：小鼠CITED1，正向 5′-TG GATGCTCGATCGTTCCG-3′, 反向 5′-GTCCATACTC GCGCGATCTGG-3′；小鼠TRAP，正向 5′-CTGATCG CATCGTATACTCGCAG-3′, 反向 5′-GTCCAATCGCG CATATTATCTGG-3′；小鼠OC，正向 5′-CGACTCGC TATCTCCAAGTGA-3′, 反向 5′-GTTGAACCAGTCTC CGACCA-3′;小鼠Alp，正向 5′-AAGCAACACTAAT AGCTCTAGGTTC-3′, 反向 5′-GGGCGACGCATACG ATGGACAAT-3′; 小鼠β-actin，正向 5′-AGTGT GACGATCGACTCATCCGTA-3′, 反向 5′-GCCAGAA CGCGCATTCTTCT-3′。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 成功构建CITED1基因全敲小鼠模型

KO新生小鼠颅骨成骨细胞CITED1几乎没有表达，敲除效果明显(P<0.001)(图1)。

*P<0.001 compared with WT group图1 KO小鼠颅骨成骨细胞中CITED1的表达Fig 1 CITED1 expression in skull osteoblasts of mice

2.2 KO小鼠骨骼长度比较

出生第一天时WT小鼠股骨长度明显小于KO小鼠(图2)(P<0.01)。

*P<0.01 compared with WT group图2 CITED1基因敲除型小鼠的长骨长度Fig 2 Lengths of long bone in KO

2.3 KO小鼠骨量和骨皮质以及骨松质厚度比较

在5周龄时KO小鼠松质骨中具有较高骨体积和骨小梁厚度(P<0.05和P<0.01)。同时皮质骨中也有很高的骨量包括骨体积和骨小梁厚度，P<0.05和P<0.01。KO小鼠松质骨的骨体积以及骨小梁的厚度和数目显著高于WT小鼠，同时KO小鼠皮质骨的骨组织面积比以及骨皮质厚度均显著高于WT小鼠(表1)。

表1 小鼠松质骨和皮质骨质量检测Table 1 Quality test of mice cancellous bone and cortical

*P<0.05,**P<0.01 compared with WT group.

2.4 小鼠骨代谢的血液学相关指标比较

KO小鼠外周血清中P1NP、OC和BALP均较WT小鼠显著增加，P<0.01，P<0.05，P<0.05)。同时，KO小鼠外周血清中TRAP的浓度较WT小鼠显著降低(P<0.05)(表2)。

表2 小鼠骨代谢的血液学相关指标检测Table 2 Hematological indexes of mice bone metabolism

*P<0.05,**P<0.01 compared with WT group.

2.5 小鼠骨标志基因的表达水平

KO小鼠颅骨成骨细胞中OC、ALP基因较WT小鼠的表达显著增加(图3) (P<0.001，P<0.01)；同时，KO小鼠颅骨成骨细胞中TRAP的表达较WT小鼠显著降低(P<0.05)。

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with WT group图3 小鼠骨标志基因的表达水平Fig 3 Expression levels of mice bone marker genes

3 讨论

共转录因子CITED的调控主要是通过与其他转录因子相互作用调控相关基因的表达。关于CITED1的研究目前主要在集中在与肿瘤的相关性，包括黑色素瘤、甲状腺癌、乳腺癌等[5]，CITED1的共转录功能主要与色氨酸磷酸化机制调控的细胞增殖周期有关[6]。然而在骨骼生长以及形成过程中CITED1的调控作用目前尚无确切研究结论，本课题在前任的工作基础上的进一步延伸和发展，利用基因敲除技术更加准确地在体水平分析CITED1的功能，探讨其作用机制。研究结果显示，CITED1敲除小鼠成骨细胞增殖能力增强，成骨细胞骨标识相关基因如OC、ALP相关基因的表达均增强。这表明CITED1在调控骨骼形成过程中具有重要作用。有研究发现CBP/P300等转录因子调控一系列基因和蛋白的表达，共转录因子CITED1可特异性地与转录因子CBP/P300结合并对其功能进行调节，抑制成骨细胞的分化[6-7]。这和本研究的在体实验结果一致。

目前已知其CITED蛋白家族共有包括CITED1，CITED2，CITED3，CITED4在内的4个成员，这4个成员均有1个约200个氨基酸残基的保守的c端转录激活域，即CR2域[8]。所有被引蛋白均通过其CR2结构域内保守的“LPXL”序列基序直接与转录整合子CBP和p300结合，这种相互作用是其活性所必需的[9]。例如,CITED1激活TGF-β和雌激素依赖的转录均依赖其CR2保守结构域，通过该结构域和CBP以及p300相互作用，靶向调控特定的转录反应，最终调控器官的生长和发育[10]。同时在肾脏发育过程中，CITED1作为一个双向转录调控因子，不仅可以激活TGF-β家族[11]，还通过抑制Wnt/β-catenin信号通路调控胚胎肾脏上皮形态的发生，最终调控肾单位形态的发育[12-13]。

本研究结果表明，CITED1是一个抑制骨形成的基因，通过促进骨吸收抑制骨形成可能在PTH调控骨代谢中具有一定的反馈抑制作用，然而对于具体的分子机制仍需要进一步去探究。有研究证实，CITED1 63-84片段丝氨酸为其重要的功能位点，影响其细胞进核及成骨分化[14-15]。未来将进一步探究CITED1在调控骨骼代谢中的关键功能位点，寻找治疗骨质疏松症等的药物研发过程中提供有相对价值的作用靶点和功能位点，为骨质疏松症的治疗提供一定的理论基础。