宋丽丽，宋鑫迪，张晓玲，王 瑶，孙可歆，李正祎

(1.北华大学医学技术学院，吉林 吉林 132013；2.吉林医药学院检验学院，吉林 吉林 132013)

环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)是一种细胞毒性药物，能通过杀伤免疫细胞影响免疫的各个阶段，具有较强的免疫抑制作用，广泛应用于制备免疫抑制动物模型[1-2]。本试验采用CTX制备免疫低下小鼠模型，使用北五味子、黄芪、麦冬复合多糖和人参皂苷(SAOG)对其进行治疗。通过检测特异性和非特异性免疫功能相关指标，观察SAOG对CTX致小鼠免疫低下的保护作用及增强免疫功能，探讨其增强免疫的作用，为其进一步应用和开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 北五味子，购自吉林省集安市五味子种植基地；黄芪、麦冬和人参，均购自安图市安兴中药饮片有限公司；北五味子多糖、黄芪多糖、麦冬多糖、人参皂苷，均由北华大学药理教研室协助提取。IL-1β试剂盒，购自上海朗顿生物技术有限公司；豚鼠血清，购自玉环县南方试剂厂；10%绵羊红细胞(SRBC)，购自北京Bersee科技有限公司；CTX，购自江苏盛迪药业有限公司；CD4-PE、CD8-PC5、CD3-FITC流式抗体，均购自天津三箭生物技术股份有限公司。

1.2 试验仪器 Infinite M200酶标仪，帝肯(上海)贸易有限公司；UV2550分光光度计，日本岛津光谱仪公司；Epics-XL流式细胞仪，贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司。

1.3 实验动物 SPF级6～8周龄，雄性ICR小鼠，体质量18～22 g，由长春亿斯实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(吉) 2016-0003，于北华大学医学动物实验室饲养，室温 20～25 ℃，相对湿度40%～60%。

1.4 试验方法

1.4.1 分组、模型制备与给药 将雄性ICR小鼠随机分为5组，设对照(正常)组(Contral group,CON)，免疫抑制模型组(Model group,MOD)，SAOG低、中、高剂量组(SAOG-Low,Medium,High dose group,SAOG-L,M,H)，剂量分别为0.4、0.8、1.6 mg/(10 g·bw)，每组各10只动物。SAOG溶液的制备见参考文献[3]。各组均按10 mL/(kg·bw)进行灌胃给药，1 次/d，连续21 d；对照组及免疫抑制模型组给予等体积生理盐水灌胃。除对照组外，其他各组在给予不同剂量SAOG溶液灌胃第17天开始，连续5 d腹腔注射CTX 20 mg/(kg·bw·d)，末次注射24 h后，采血并剖检测定各项指标。

1.4.2 SAOG对小鼠肝脏的影响 称量各组小鼠体质量，脱颈椎处死小鼠。取其肝脏，剪去脂肪和筋膜组织称量肝脏质量，计算脏器指数。脏器指数=脏器质量(mg)/体重(g)。随后剪取0.5 cm3的肝脏组织块于10%福尔马林溶液中固定，按5 μm厚度制备石蜡切片后苏木精-伊红(H.E.)染色，中性树胶封片，显微镜下(放大200倍)观察病理变化。

1.4.3 外周血液淋巴细胞CD3+、CD4+、CD8+T细胞分群 每管加入CD4-PE、CD8-PC5、CD3-FITC(2∶3∶3混合)混合抗体8 μL，全血50 μL；室温条件下避光孵育30 min；裂解红细胞，清洗2次；加细胞固定液100 μL /管后进行流式分析。

1.4.4 测量血清溶血素 在灌胃后第17天，通过给免疫小鼠腹膜内注射0.2 mL 5% SRBC，5 d后将小鼠麻醉摘除眼球后采血。将血液静止10 min后，以1 500 r/min离心10 min以获得血清，用生理盐水稀释100倍；分别将0.5 mL稀释的血清(对照组中加0.5 mL生理盐水)与0.5 mL 5% SRBC悬浮液，0.5 mL 10%补体(豚鼠血清)溶液和0.5 mL生理盐水混合，然后在37 ℃放置30 min后立即放入冰水浴中停止反应。将该混合物以1 500 r/min离心10 min以获得上清液，在540 nm波长处测定吸光值A，以生理盐水作空白调零。血清溶血素含量(HC50)根据下式计算：

HC50=样品吸光度/SRBC 半数溶血时的吸光度×稀释倍数

1.4.5 血清IL-1β水平检测 将小鼠摘除眼球取血后，离心取上清液。采用ELISA 法检测各组小鼠血清IL-1β水平，具体操作根据试剂盒说明书进行。采用全波长酶标仪检测450 nm波长处A450值，绘制标准曲线，计算IL-1β含量。

2 结果

2.1 SAOG对小鼠脏器指数的影响 结果如表1。由表1可知，腹腔注射CTX之后，与对照组相比免疫抑制模型组小鼠的体重出现很大程度的降低，表明建模成功。与对照组相比，模型组小鼠肝脏指数显著升高(P<0.05)；SAOG-H组肝脏指数与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。说明CTX对肝脏有损伤作用，可能是由于CTX主要代谢产物丙烯醛对肝脏产生的毒性作用，而SAOG能够明显减轻肝脏损伤程度，但SAOG-L/M组从外观肝脏颜色及肝脏指数结果上看，虽与对照组无明显差异，但略有好转。

表1 SAOG对小鼠脏器指数的影响Table 1 Effects of SAOG visceral index of mice

2.2 SAOG 对免疫低下小鼠血清溶血素水平的影响 结果见图1，模型组小鼠血清溶血素水平较正常组降低明显，差异有统计学意义(P<0.05)，提示 CTX 有显著抑制小鼠血清溶血素水平的作用，CTX致小鼠免疫低下模型构建成功。SAOG-M/H组小鼠血清溶血素水平与模型组相比均显著升高(P<0.05)，表明SAOG能有效提高CTX致免疫低下小鼠血清中溶血素含量，SAOG-L组SAOG小鼠血清溶血素水平与模型组相比虽无统计学差异，但略有提高。

图1 小鼠血清溶血素的测定Fig.1 Detection of serum hemolysin in mice注：与模型组比较，*：P<0.05；与对照组比较，#：P<0.05Note:Compare to model group,*:P<0.05.Compare to control group,#:P<0.05

2.3 SAOG对CTX 致免疫低下小鼠T淋巴细胞分化成熟的影响 不同剂量组的SAOG对CTX 致免疫低下小鼠外周血T淋巴细胞亚群比例的影响如表2所示，结果表明：与模型组相比，SAOG-L/M/H剂量组CD3+T细胞、CD4+T细胞的百分比及CD4+/CD8+T细胞的比例均上调，且存在剂量-反应关系，但对CD8+T细胞的影响剂量反应关系不明显。与模型组相比，SAOG-L/M/H各剂量组均对CD3+T细胞、CD4+T细胞及CD4+/CD8+T细胞影响，组间有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。

表2 SAOG对小鼠外周血T淋巴细胞亚群百分数及比例的影响Table 2 Effects of SAOG on the percentage of T cell subsets in mice peripheral blood

2.4 SAOG对CTX致免疫低下小鼠血清中细胞因子的影响 如图2所示，与对照组相比模型组IL-1β明显降低(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较，SAOG-M/H组IL-1β浓度明显增高(P<0.05)。

图2 血清IL-1β浓度检测Fig.2 Detection of serum IL-1β concentration注：与模型组比较，*：P<0.05；与对照组比较，#：P<0.05Note:Compare to group model,*:P<0.05.Compare to group control,#:P<0.05

2.5 SAOG对CTX致免疫低下小鼠肝脏病理形态学的影响 肝脏组织石蜡切片结果显示(见封三彩版图3)，对照组小鼠肝脏高倍镜下显示，肝索排列整齐，小叶结构清晰完整，肝细胞形态良好排列整齐，双核肝细胞较多胞核近圆形，中央静脉和汇管区结构正常，未见肝实质细胞病变；模型组小鼠，肝小叶中央静脉周围肝细胞体积增大，细胞胞浆疏松淡然，肝血窦变窄或消失，肝细胞水肿较明显；SAOG各剂量组肝脏组织高倍镜下显示与正常对照组未见明显差异。

图3 小鼠肝脏组织病理学检测 (H.E.染色，200×)Fig.3 Mice liver tissues detected by histopathology (H.E.staining,200×)A：对照组；B：模型组；C：SAOG低剂量组；D：SAOG中剂量组；E：SAOG高剂量组A:Control group;B:Model group;C:SAOG-Low dose group;D:SAOG-Middle dose group;E:SAOG-High dose group

3 讨论

中国拥有数千年研究中药的历史，在古代一直用中药治疗各种疾病，中药种类繁多，其中很多都具有免疫调节作用。如中药中含有的多糖为常见的免疫调节性物质，对机体细胞/体液免疫及非特异性免疫均有广泛的影响。中药中含有的苷类化合物也是常见的可以发挥免疫调节、增强机体免疫功能的作用的免疫调节性物质。本试验所用复方中药主要用于调节免疫功能，由北五味子、黄芪、麦冬、人参(Schisandra,Astragalus,Radix ophiopogonis,Ginseng,SAOG) 按原药1∶5∶2∶1组成[3]。北五味子、黄芪、麦冬提取多糖，人参提取皂苷。五味子是著名的滋补性中药，多糖含量丰富，具有明显的免疫调节作用[4]。黄芪有“补气升阳之王”的美誉，其多糖成分是一种免疫调节剂，长期试验证明其无毒副作用。大量研究表明,黄芪多糖具有免疫调节和增强作用，且涉及到特异性和非特异性免疫等诸多方面[5-6]。麦冬多糖为麦冬发挥增强免疫作用的有效部位，除药用外，麦冬作为保健饮品和功能性食品也受到了国际保健食品界的青睐[7]。人参皂苷具有提高机体非特异性免疫和特异性免疫功能[8]。

本试验在提取北五味子、黄芪、麦冬多糖、人参皂苷的基础上，通过腹腔注射CTX建立免疫抑制模型，经多项免疫指标研究SAOG对小鼠免疫抑制的调节效应。通过测定血清溶血素水平，用以检测药物对机体防御能力的影响。本试验结果表明,SAOG能显著提高免疫抑制小鼠血清溶血素水平，对免疫反应起正调节作用。同时试验结果还表明，SAOG 能显著提高免疫抑制小鼠外周血免疫细胞分泌细胞因子IL-1β，对免疫反应起正调节作用。根据试验结果SAOG正向调节小鼠机体免疫功能，可能源自其对T淋巴细胞分化成熟的调节作用。该作用不仅提升了小鼠细胞免疫水平，还促进了免疫细胞分泌各种淋巴因子。

CD4+/CD8+T细胞常作为免疫调节的一项指标，免疫力低下者常存在T细胞亚群比例异常现象，具体表现为CD3+T、CD4+T细胞总数减少，CD4+/CD8+T细胞比值下降，因此可通过检测外周血淋巴细胞CD4+/CD8+T细胞比例作为判断机体免疫功能状态的一项指标。若CD4+/CD8+T细胞比例上升，则提示正向免疫调节占优势，反之则为负向免疫调节占优势。本试验结果显示，SAOG可以正向调节小鼠的机体免疫功能。

细胞因子是免疫系统的重要组成部分，是由活化的免疫细胞和相关细胞产生的多肽分子或糖蛋白，具有高活性，可执行多种生理功能，同时也是免疫系统调节营养代谢的主要介质。细胞因子的含量代表着免疫系统的自身代谢状态。本试验结果显示，SAOG-M/H组小鼠细胞因子IL-1β的表达水平明显升高进而发挥免疫增强作用。

肝脏是机体固有免疫功能的主要执行者，调节固有免疫和适应性免疫之间的平衡关系，是机体防御侵害的重要天然屏障。CTX对肝脏的毒性作用较大[9-10]，本试验中，CTX模型组小鼠肝脏肿大呈黄红色，胆囊萎缩，肝细胞有坏死、凋亡现象。SAOG各给药组能明显缓解CTX引起的肝损伤症状，但各组之间病理切片镜下无明显差异。推测原因为小鼠肝脏再生能力较强，同时SAOG具有一定的减轻细胞炎性浸润，减轻肝细胞水肿，促进肝细胞再生的作用。已有研究表明，CTX造成的肝脏损伤在不同物种间的差异性小，不同来源的多糖对这种损伤都有明显的缓解能力[11-12]。

导致机体免疫功能紊乱的原因较多。与西药调节机体免疫功能相比，中药较多为天然药物，具有不良反应小，副作用弱，价格便宜，物产丰富，药效稳定持久等优点。中药具有免疫调节作用的主要成分包括多糖、苷类化合物、生物碱、挥发油、有机酸等[13]。SAOG充分发挥了北五味子、黄芪、麦冬、人参的最有效免疫调节活性成分，以中医基础理论知识为指导，调节机体平衡，纠正免疫功能紊乱。中医理论认为，化疗药物属于外来毒邪，作用于机体可损伤正气，致使正气虚损。因此，化疗后免疫抑制当属中医学“虚劳”“虚损”范畴。SAOG采用扶正培本法[14]，扶助正气，培植本元，从而调节机体阴阳气血、脏腑经络的生理功能，提高机体抗病能力，增强免疫功能。

综上所述，SAOG能显著增强小鼠免疫功能，为有开发前景的、有效的能增强免疫功能的组合方。