杜雨蒙 刘林夕 褚雨

胃癌(gastric cancer)是世界上所有癌症中导致死亡的第二大原因，在2018年造成全世界782 685例死亡[1,2]。目前，胃癌的发病率明显增加，每年约有1 033 701例新发病例，其中中国的胃癌风险最高，占世界新发病例的43%，尽管在过去几十年中诊断和治疗方法有所改善，但胃癌的预后仍然很差[3,4]。 因胃癌确诊多数已到晚期，在临床治疗中需要开发新的高效、低毒、耐药的抗癌药物。中药成为晚期癌症患者的首选药物，其中多糖类药物已在临床治疗晚期癌症或放化疗抗性癌症中占据重要地位。青果(canarii fructus)是橄榄科植物的干燥果实，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤的功效[5]。近期，有研究报道，青果粗多糖可抑制宫颈癌细胞的增殖[6]，但是其多结直肠癌细胞的生物学作用及机制尚未清楚。本研究拟以胃癌细胞MKN45为研究对象，检测青果多糖组分CFW对MKN45细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响，揭示其机制与抑制ERBB信号通路相关，为青果多糖组分CFW在癌症中的治疗价值的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌细胞MKN45购自ATCC；青果购自四川新荷花中药饮片有限公司；DMEM培养基、胎牛血清、MTT、胰蛋白酶均购自美国Sellect公司；LipofectamineTM2000、BCA蛋白定量试剂盒、逆转录试剂盒购自大连Takara公司；Annexin V- FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝公司；PVDF膜购自德国罗氏诊断有限公司； SDS-PAGE 试剂盒、ECL发光液和RIPA蛋白裂解液均购自碧云天生物技术公司；Matrigel基质胶、Transwell小室购自美国Coming公司；凝胶成像分析仪购自柯达公司；半干转膜仪购自美国BIO-RAD公司；ABI 7500型实时荧光定量PCR系统购自美国ABI公司；Genesys 10紫外分光光度计购自美国Thermo公司；PCR 仪购自美国BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:将人胃癌细胞MKN45用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃,5% CO2的恒温培养箱中常规培养，待细胞生长至融合度75%左右，用胰蛋白酶消化约1 min，进行传代。

1.2.2 细胞转染与分组:按照刘梅等[7]的方法，先通过乙醇除脂、水提、醇沉的方法得到青果粗多糖，再用DEAE琼脂糖凝胶FF进行青果粗多糖的部位分离，最后通过苯酚-硫酸法测定青果多糖中的总多糖，BCA蛋白定量试剂盒测定CFW的总蛋白含量。然后用含有10% 胎牛血清的DMEM培养液配置CFW(0.5、1.0、1.5 g/ml)。把培养至24 h的胃癌细胞MKN45用CFW(0.5、1.0、1.5 g/ml)处理培养48 h，用MTT法检测CFW对胃癌细胞抑制率的影响，筛选出最适浓度1.06 g/ml用于后续试验。 再将ERBB信号通路抑制剂PF299804或DMSO处理经1.06 g/ml CFW治疗的MKN45细胞24 h，分别标记为CFW+DMSO组、CFW+PF299804组。

1.2.3 MTT法检测细胞抑制率和增殖:将细胞制成混悬液，调整密度至104个/ml，然后接种至96孔板，取适量细胞，每孔加MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，孵育4 h，终止培养，弃去培养液上清，然后每孔加150 μl DMSO，振荡使结晶充分融解，在490 nm波长下检测细胞吸光度(A)。细胞抑制率=[1-A490样品/A490对照]×100%，细胞增殖能力与细胞的吸光值成正比。

1.2.4 Transwell小室检测细胞迁移和侵袭:将细胞以106个/孔接种细胞6孔板，常规培养至细胞融合度达到90%，更换为对应的无血清培养基培养过夜。调整个组细胞密度为105个/ml，取100 μl加入上室内，600 μl 含血清的培养基加入下室内，细胞常规培养过夜。取出小室，用棉签擦去上室内的细胞，PBS洗涤2次，甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色20 min，PBS洗涤2次。显微镜下观察小室下表面附着的迁移细胞，随机取3个视野拍照计数，取平均数。将Transwell小室上表面铺适量厚度的基质胶，然后按照上述操作方法操作。最后显微镜下观察小室下表面附着的侵袭细胞。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI流式细胞术实验:将收集的细胞用500 μl的结合缓冲液悬浮，分别加入5 μl的 Annexin V-/FITC避光反应20 min后再加入5 μl的PI避光反应20 min，用300目铜筛过滤，最后在1 h内上流式细胞仪结束检测。细胞的凋亡率(%)= 早期凋亡率+晚期凋亡率。每个样品重复3次。

1.2.6 Western blot检测细胞中P21、Bax、Twist、MMP-2、Bcl-2、ERBB的蛋白表达:RIPA蛋白裂解液对细胞进行冰上蛋白裂解30 min，提取总蛋白，以BCA法测定样品蛋白的浓度。以4∶1的比例加入蛋白上样缓冲液，混匀，沸水浴变性5 min，离心取上清，取60 μg目的蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳。然后将蛋白湿转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗涤，4℃条件下，将封闭后的PVDF膜放入倍比稀释的一抗中反应过夜，以封闭液洗膜3次，每次5 min，再在37℃下将PVDF膜转入倍比稀释的二抗中反应2 h。于暗室内ECL试剂盒显影曝光：滴加化学发光剂显影，以凝胶成像系统采集图像。Image J分析目的条带的灰度值，以GAPDH为内参，以目的条带灰度值与GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表达情况。

2 结果

2.1 青果水部位多糖组分CFW含量的测定 通过乙醇除脂、水提、醇沉的方法制得的青果粗多糖的出糖率为7.09%。DEAE琼脂糖凝胶FF分离得到的青果粗多糖的水部位CFW得率为35.98%，苯酚-硫酸法测定青果水部位多糖中的总糖含量为(79.86±1.29)%，用BCA法测得CFW中的总蛋白含量为(14.23±0.86)%。

2.2 CFW对胃癌细胞的抑制作用 用MTT法检测CFW(0.5、1.0、1.5 g/ml)对胃癌细胞抑制率的影响。与对照组相比，0.5 g/ml组、0.5 g/ml组、0.5 g/ml组MKN45细胞的抑制率均显著升高(P<0.05)。CFW浓度与抑制率的相关系数R2为0.9913，CFW对胃癌细胞的半数抑制率为1.06 g/ml。故选用1.06 g/ml的CFW用于后续试验。见表1。

表1 CFW对胃癌细胞的抑制作用

2.3 CFW对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响 与对照组相比，CFW组MKN45细胞在48、72 h时，细胞增殖显著降低，迁移细胞数和侵袭细胞数均显著降低，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 CFW对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

2.4 CFW对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡相关蛋白表达 Western blot检测细胞中组织、迁移、侵袭和凋亡相关蛋白的表达，与对照组相比，CFW组MKN45细胞P21、Bax蛋白表达显著升高，Twist、MMP-2、Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)。见表3，图1。

表3 CFW对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡相关蛋白表达的影响

图1 CFW对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡相关蛋白表达的影响

2.5 CFW对胃癌细胞ERBB信号通路的影响 与对照组相比，CFW组MKN45细胞中ERBB的mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.05)。见表4。

表4 CFW对胃癌细胞ERBB信号通路的影响

2.6 抑制ERBB信号通路对CFW的胃癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响 与CFW+DMSO组相比，CFW+PF299804组MKN45细胞中ERBB表达显著降低，在48、72 h时，细胞增殖显著降低，迁移细胞数和侵袭细胞数均显著降低，细胞凋亡率显著升高，细胞中P21、Bax蛋白表达显著升高，Twist、MMP-2、Bcl-2蛋白表达均显著降低(P<0.05)。见表5、6。

表5 抑制ERBB信号通路对CFW的胃癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响

表6 抑制ERBB信号通路对CFW的胃癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡相关蛋白表达的影响

3 讨论

植物多糖对癌细胞具有很强的抑制作用，如香菇多糖可作为肝癌的辅助治疗药物，黄芪多糖、竹叶多糖、人参多糖、枸杞多糖和灰树花多糖均具有抗肿瘤的功效[8]。中药在中国具有悠久的历史，但是由于其成分复杂、功能机制不清、缺乏理论依据，以至于在世界范围内难以推广。因此，中国传统中药的机制研究成为焦点。刘梅等[7]在青果多糖的研究中发现，青果水部位多糖组分CFW可抑制胃癌、乳腺癌、肝癌细胞增殖的作用，提示其在抗肿瘤药物的筛选中具有巨大潜力，遗憾的是，CFW的抗肿瘤功能的机制未继续研究。本研究通过MTT法检测了CFW对胃癌细胞的抑制率发现，CFW对胃癌细胞具有浓度依赖性抑制作用，且其半数抑制率为1.06 g/ml；进一步研究，通过Transwell、流式细胞术检测CFW对胃癌细胞迁移、侵袭及凋亡的影响发现，CFW可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进凋亡，这些结果均与刘梅的实验结果相呼应，其中CFW的抑制胃癌细胞迁移侵袭，促进凋亡的功能是国内外首次发现的，这揭示了CFW可调控胃癌细胞的细胞表型变化；深入研究发现，通过Western blot检测CFW治疗的胃癌细胞中增殖、迁移侵袭及凋亡相关的蛋白表达发现，CFW可上调增殖抑制蛋白P21、下调迁移侵袭促进蛋白Twist和MMP-2，上调凋亡促进蛋白Bax，下调Bcl-2，这进一步说明，CFW对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用及凋亡的促进作用的功能机制。有趣的是，我们还发现，CFW对胃癌细胞中ERBB信号通路的关键蛋白ERBB的表达具有明显的抑制作用，提示CFW可失活胃癌细胞中ERBB信号通路的活性，推测该通路可能与CFW的功能具有一定的相关性。 ERBB是酪氨酸激酶型受体，当其与配体结合后会发生磷酸化，进而激活下游的信号通路，抑制肿瘤发生恶化[9,10]。 Zhang等[11]在胃癌的研究中发现，糖基磷脂酰肌醇与anchor attachment蛋白复合物GPAA1在胃癌中发挥致癌作用，其表达显著升高，促进EGFR和ERBB2之间的相互作用以及下游促增殖信号的传导，这说明ERBB信号通路在胃癌恶性化进展中具有促进作用。曹源[12]在胃癌的研究中报道，miR-214靶向CREB1引起转录失调、ERBB信号通路激活、细胞自噬及泛素蛋白水解，进而增强胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭，这说明ERBB信号通路活性增强有利于胃癌的恶化。本研究结果发现，CFW治疗后，胃癌细胞中ERBB信号通路的活性收到抑制；进一步研究发现，抑制ERBB信号通路后，胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的能力显著降低，凋亡能力得到增强，并且上调P21、Bax，下调Twist、MMP-2、Bcl-2，这说明CFW的功能机制确实与抑制ERBB信号通路的活性有关，这为CFW的功能机制研究提供参考，也为CFW在临床上的应用提供充分的理论依据。 综上所述，青果多糖组分CFW可抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭，促进凋亡，其机制可能与抑制ERBB信号通路相关，为CFW用于治疗胃癌提供理论依据。