赵曦，郑德洪

（广西大学农学院 南宁市 530004）

1 植物病原细菌的概述及其为害

许多植物病原细菌引发的重要病害，给各国农业生产造成巨大的经济损失，尽管许多研究学者不断研究对抗植物病原细菌的防治办法，但依然较难防控病原细菌病害。

1.1 丁香假单胞菌

丁香假单胞菌能够引起菜豆晕疫病、桃树溃疡病、十字花科黑斑病、番茄细菌性叶斑病等，现已感染300 多种经济作物，包括豆科、十字花科、蔷薇科、茄科等，是引发植物病害十大病害之首[1]。

1.2 青枯雷尔氏菌

青枯雷尔氏菌可能是世界上最具破坏性的植物病原细菌。它是一种土壤传播的病原体，通过植物的伤口、根尖或侧根出芽处的裂缝感染植物，造成植物整株萎蔫。由于青枯雷尔氏菌遍布世界许多国家和地区，它们的地理来源、宿主范围和致病行为各不相同，在热带地区的许多发展中国家的农业中发病率较高[2]。

1.3 农杆菌

农杆菌是冠瘿瘤的病原体，冠瘿瘤是世界范围内影响各种作物的最严重的植物病害之一。在自然界中，这种土壤细菌在寄主植物的伤口部位诱导肿瘤生长，严重限制了作物的生长能力和产量。

1.4 水稻黄单胞菌

水稻黄单胞菌是一种棒状革兰氏阴性细菌。它产生一种黄色的可溶性色素（称为菌黄素）以及胞外多糖。胞外多糖在保护细菌免受环境影响以及帮助细菌在风、雨传播扩散方面具有重要作用。水稻黄单胞菌的传播途径包括灌溉用水系统、水花飞溅或风吹雨淋，以及最重要的初级接种源是受侵染的上一季稻茬。水稻黄单胞菌引起的水稻白叶枯病对水稻产量影响非常大，减产达20%～30%严重可达50%～60%甚至颗粒无收[2]。

2 植物细菌病害防治手段

国内外研究学者对植物病害的防治进行了大量的研究，目前的防治措施有以下几类：

2.1 化学药剂

由于化学药剂成本较低，人们对其使用不加以限制，出现滥用、过量使用化学药剂的情况。不同种类的化学药剂的使用，对环境和人体都存在负面影响。抗生素的滥用还会导致一些植物病原菌对抗生素的抗性，植物病原菌对抗生素的耐药性已成为防治病原细菌的严重问题[3-5]。常用的抗生素类杀菌剂如农用硫酸链霉素、中生菌素等使病原细菌产生较强的抗药性，防治效果较差且对人体、动物及环境有较强的毒害作用，国家即将出台政策将抗生素类化学药剂列为“处方药”，不得滥用[6]。

常用的铜基化合物杀菌剂如无机铜化物、碱式硫酸铜（波尔多液）等。自1885 年波尔多液首次用于植物病害防治以来，大量的铜基抗菌化合物被开发应用于植物保护，铜基化合物对植物病原细菌有较强的毒性，对动物的毒性较低且制作成本低廉。随着铜基抗菌化合物大量频繁的使用，许多病原细菌对铜基化合物产生了抗性。铜基化合物大多为碱性，无法与其他农药混用，可混性差，且重金属对环境的污染，引起人们对生态系统长期可持续性的担忧[4]。

2.2 土壤处理

土壤处理法处理一些土传病害，使用土壤添加剂、土壤暴晒和熏蒸等方法。例如利用塑料薄膜覆盖地面，膜下灌水淹没土壤，密封30 d左右，如遇连续高温，土壤温度可达60℃，20 d 即可起到杀虫杀菌的作用[7]。缺点是操作有一定难度，同时会对土壤中的一些有益微生物造成损害。

2.3 轮作

合理的轮作能够在一定程度上降低少数植物的病原细菌的为害。如烟草黑胫病、蚕豆根腐病、甜菜褐斑病、西瓜蔓割病和番茄青枯病等均通过土壤侵染。如将感病的寄主作物与非寄主作物实行轮作或水旱作物轮作，便可较大程度地减少这种病菌在土壤中的数量，减轻病害；同时也可减少作物根部的线虫，使其在土壤中的虫卵数量减少，达到减轻危害的目的。

2.4 选育抗病品种

抗病品种是利用常规杂交育种技术结合分子标记辅助选择技术，快速高效地选育优良品种的一种技术手段[8]。抗病品种的选育能够使该品种在一定程度上减少病虫害的发生。例如杂交得到感温型常规稻品种白丝占，能够抗白叶枯强病毒菌系Ⅴ型菌兼抗稻瘟病，抗白叶枯病（Ⅳ型菌1 级，Ⅴ型菌3级）[9]。

3 噬菌体

3.1 噬菌体

噬菌体是一种专门杀死细菌的病毒，但对非靶向的细菌和人类无毒[10]。早在100 多年前被发现，但当时抗生素的崛起，导致科研人员搁置了对噬菌体的研究。由于时代的发展，人们越来越重视生态环境的保护。细菌对抗生素产生耐药性，以及使用化学品对环境可能产生的不良影响，使人们重新对开发替代控制策略来防治植物中的细菌性病害产生了兴趣[11]。噬菌体是通过在细菌内感染、复制、传播。噬菌体在生态系统中广泛存在且种类丰富，存在于所有可以发现细菌的环境中，在人类和动物身上也有他们的身影，在生态系统营养循环、细菌病原体的进化等方面起着非常重要的作用。噬菌体和细菌在进化中势均力敌，不相上下。尽管我们看不到噬菌体，但它对我们的生活依然起到相当重要的作用。噬菌体作为生物农药正在被广泛研究。

3.2 噬菌体的分类

噬菌体根据核酸类型可分为四大类：单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）、单链RNA（ssRNA）、双链RNA（dsRNA）。由于噬菌体专性寄生于易感染病原细菌，按照噬菌体在宿主细胞体内呈现的生命状态可分为4 种：裂解性、溶原性、伪溶原性和慢性感染[12]。根据形态大体分为头尾、瓶状、丝状、水滴状、杆状、球状等[13]。现有关于噬菌体的报道大多为裂解性噬菌体，近几年相继出现了利用丝状噬菌体治疗的报道[14-15]。

头尾结构的噬菌体是通过中空的尾部将遗传物质注射到宿主菌细胞内，一旦进入细胞，噬菌体就会利用宿主菌细胞的代谢机制，在细胞内完成遗传物质的复制、组装，最后裂解宿主细胞。宿主细胞被裂解后释放大量子代噬菌体，子代噬菌体再次侵入相邻细胞，循环往复。丝状噬菌体，由几千个不等（例如M13由6 407个核苷酸）的核苷酸构成一个环状单链DNA，呈螺旋阵列排列，再由长丝的管状衣壳蛋白包裹着[16]。丝状噬菌体相对温和，不会溶解宿主细胞，与宿主细胞共生共存。丝状噬菌体进入细胞后，在细胞内繁殖，再从细胞内源源不断地分泌出来，噬菌体在细胞内持续释放病毒粒子，但噬菌体的合成和释放都不会破坏细胞或使细胞裂解，细胞处于持续感染状态。例如丝状噬菌体VGJφ、CTXφ和φRSM1从霍乱弧菌基因组中切除一部分碱基对，但不会杀死宿主细胞[17]。

4 噬菌体防治细菌病害的应用

在许多年前，研究学者已经认识到噬菌体能够很大程度影响细菌基因组进化[15]。利用基因工程改造噬菌体，能够直接或间接赋予噬菌体杀菌能力，例如将rpsL和gyrA基因整合到温和噬菌体中，受感染的病原细菌对链霉素敏感[18]。随着人口增长对粮食产量的巨大需求，噬菌体防治病害的应用与日俱增，噬菌体既可以作为单独的防治策略，也可以作为综合防治的一部分。

Kelvin Kimutai Kering 发现噬菌体混合物可以与低浓度的CuSO4一起用于杀死更多的植物病原菌[19]。Flaherty 等人利用突变噬菌体对天竺葵白叶枯病进行防治，每日喷洒突变噬菌体混合液于湿润天竺葵叶片表面，与对照组（未喷洒噬菌体混合液）相比，每天使用噬菌体混合物降低了70%～85%的发病率[11]。Obradovic 利用噬菌体合成孔径雷达诱导剂在6周左右的番茄根部施药，能够显著降低番茄细菌斑病的发生[20]。Adriaenssens 利用噬菌体øAS1浸泡受感染的马铃薯种子块茎，软腐病病情明显减轻，产量增加13%[21]。Das等人利用噬菌体鸡尾酒疗法提前处理未发病的葡萄藤，预防通过昆虫传播的葡萄皮尔斯病，能够明显降低葡萄皮尔斯病的发病率[22]。Rombouts 利用从韭菜白叶枯病地区土壤中分离、筛选到噬菌体，提前用噬菌体浸泡韭菜苗再将其种植在含有紫丁香单胞菌的地区，韭菜白叶枯病的发病率明显降低。或种植韭菜后喷洒噬菌体混合液，喷洒噬菌体混合液的韭菜与未喷洒噬菌体的对照组发病率分别为38.5%和63%。两种方法都能能够明显抑制韭菜白叶枯病的发病[23]。Wei利用噬菌体鸡尾酒疗法防治马铃薯青枯病，将6种噬菌体混合液注入植株能使80%的马铃薯免受青枯病困扰，喷洒混合液一周后能够杀灭土壤中98%的青枯菌[24]。Muturi利用噬菌体抑制果胶杆菌引起的肯尼亚马铃薯软腐病，在马铃薯切片上接种细菌前后1 h，涂抹噬菌体，可使软腐病减轻90%以上[25]。Denyes 等人利用噬菌体具有特异性的特点对大量食源性细菌进行稳健和特异性诊断，不仅可以降低食源性疾病的发病率，还可以降低传统病原体检测的昂贵费用[26]。越来越多的研究学者利用噬菌体防治病原细菌，噬菌体作为农业生产防治有很大的发展前景。

5 噬菌体的优势

5.1 噬菌体在环境中的优势

噬菌体是包括根系在内的生态系统中最丰富的生物之一，在细菌的进化过程中起到了至关重要的作用。而且噬菌体对环境没有毒性，不会造成环境污染。1921年Bruynoghe等最先使用噬菌体制剂治疗皮肤葡萄球菌化脓性感染，病情在2 d内有所好转，身体其他部位未受影响[27]。

由于噬菌体有很强的生物特异性，只感染宿主细菌，对非靶向细胞没有识别能力，对环境中的其他菌群不产生影响，不会破坏土壤微生物的多样性，可满足当代提倡的绿色无公害农业要求。

5.2 噬菌体在基因组学方面的优势

尽管噬菌体的基因组相对较小，但是对宿主细胞的影响却很大[16]。由于噬菌体基因组碱基或碱基对数量少，使得噬菌体的基因组测序、分子克隆和基因组学研究都相对容易[28]。噬菌体基因组较小，但是依旧能够从已被大家熟知的噬菌体中揭示新的信息，说明与它们的小体积相比，它们对病原菌的行为和进化都有重要影响[16]。噬菌体也会根据病原菌的突变产生适当的变异，传统细菌病害防治手段则不具备这种优势。

5.3 噬菌体在实际应用中的优势

噬菌体由于基因组序列较小，研制开发所需的时间短、成本低，仅需将噬菌体与宿主菌细胞共培养，通过离心就可以去除细菌碎片获得噬菌体粗提物。例如Wei从不同地区含有青枯病的土壤中分离到的噬菌体，通过噬菌体与高浓度的宿主菌细胞共培养一段时间后离心得到的噬菌体用于实验[24]。得到的噬菌体易于保存，在4℃条件下可以储存几个月没有明显的消亡。

6 噬菌体在实际应用中面临的问题

噬菌体无法自我复制，需要在宿主细胞内复制繁殖，如果没有宿主细胞，噬菌体无法在环境中长期存活，会在较短时间内凋亡。一般噬菌体对植物病原细菌的防治是将噬菌体施用于植物根际，由于噬菌体的结构不太稳定，在环境中长期储存有一定困难，会受到土壤中其他微生物、土壤的pH、紫外线等因素影响。

由于细菌和噬菌体之间无休止的争夺，细菌已经进化出噬菌体抗性，例如毒素—抗毒素系统、CRISPR CAS免疫系统，会使噬菌体无法进入病原细菌或一旦进入，病原细菌启动自杀系统，防止噬菌体在细菌内复制合成[29]。宿主细胞对噬菌体也可以产生抗性突变，宿主菌细胞的受体对于噬菌体侵染细菌起着至关重要的作用。如果宿主菌细胞突变与噬菌体结合的受体，使噬菌体受体不可接近宿主细菌或与宿主细菌受体结合蛋白不互补，噬菌体就失去了有效感染宿主的能力。受体结构的改变以及噬菌体受体的丧失也可能导致吸附受阻[30]。

化学物质对噬菌体的影响研究至今还相对较少，但是表面活性剂和天然有机物会影响噬菌体的存活，其中表面活性剂破坏性较强[31]。

施用噬菌体24 h 后，其存活率明显降低。频繁施用噬菌体是目前提高防治效果最有效的方法。但在日常应用上，经济条件是主要问题，需要评估和寻找延长作物中的噬菌体寿命的化合物平衡环境与条件。

7 如何提高噬菌体对细菌病害的防治效果

由于噬菌体结构的特点，不易在环境中长期存活，但在溶液中具有一定的稳定性[32]，考虑到噬菌体的蛋白质结构，可以添加赋形剂或者将噬菌体溶液转化成粉末制剂作为提高噬菌体稳定的手段[19]。针对噬菌体对温度、pH、紫外线等环境因素的敏感性，可调整施用时间，如夜间或清晨使用噬菌体制剂，延长噬菌体存活时间，以尽可能多的感染病原细菌。此外，噬菌体可以通过基因改造，降低病原细菌对噬菌体产生抗性的可能[33]。可以利用噬菌体依附在无毒性的病原细菌内投入环境中进行生物防治。

8 展望

随着社会的发展，人们越来越重视抗生素等传统防治手段对环境的破坏，为实现自然生态协调可持续发展的环境友好型社会，各界研究学者努力寻找新型生物防治办法抵御病原细菌。噬菌体有价格低廉、数量庞大、易于生产、保存便利等特点，已然成为极其重要的生物防治手段之一。噬菌体作为生态系统中存在范围最广，数量、种类都非常繁多的生物，对特定病原细菌的特异性极强，且对环境、人体及其他细菌没有毒害作用，有利于环境保护。在噬菌体与细菌争夺战中，噬菌体一直占据着有利条件。相比化学药剂在很大程度上降低了病原细菌抗性的产生。噬菌体作为植物病害生物防治还处于研究阶段，研究学者可以通过各种途径对噬菌体进行探索和研究，未来利用噬菌体作为植物病害的生物防治手段有良好的发展前景。