赵 铮， 李 毅， 杨飞翔

（湖北医药学院附属东风医院检验科，湖北 十堰 442000）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，每年发病率占女性恶性肿瘤的29%[1]。内分泌治疗是雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性乳腺癌最有效的治疗手段。有研究结果显示，内分泌治疗可降低ER阳性乳腺癌患者的复发和死亡风险，提高生存率[2]。内分泌治疗药物的耐药会使乳腺癌治疗难度增加。有调查结果显示，约有25%的ER阳性乳腺癌患者对他莫昔芬（tamoxifen，TAM）初始治疗无效，即使在首次TAM治疗有效的患者中，也有40%最终可能会发展成获得性耐药[3]。因此，探讨TAM的耐药机制对乳腺癌临床治疗具有重要的指导意义。转录因子NKX2-5是NK同源盒-2基因的成员，主要表达于心脏组织，维持心脏的正常发育和功能[4]。近来年，有学者发现部分恶性肿瘤中NKX2-5表达异常，与肿瘤的发生、发展关系密切，如前列腺癌等实体瘤中NKX2-5表达下调，并与患者不良结局呈负相关[5]。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路在乳腺癌内分泌治疗药物耐药机制中扮演着重要角色。有研究结果显示，阻断MAPK信号通路可以抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移，而激活该信号通路会增强ER转录效率并导致TAM耐药[6]。本研究拟分析NKX2-5是否能通过阻断MAPK信号通路逆转TAM耐药。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2012年7月—2016年7月在湖北医药学院附属东风医院采用规律内分泌药物（TAM 20 mg/d）治疗的乳腺癌患者50例，年龄23～73岁。收集所有患者TAM治疗前切除的乳腺癌组织及对应的癌旁组织样本。纳入标准：病理检查证实为乳腺癌，入院前未接受过放疗、化疗、激素治疗或其他抗癌治疗。排除合并其他恶性肿瘤者。50例患者中有18例（36.0%）发生TAM耐药，再次收集TAM耐药患者的组织样本。组织样本取出后立即置于液氮中保存。本研究经湖北医药学院附属东风医院医学伦理委员会批准，所有患者治疗前均签署知情同意书。

1.2 数据库分析

从高通量基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）下载乳腺癌患者基因表达数据（GSE42568），通过整理数据库中的相关数据，分析患者总生存率、无复发生存率与肿瘤组织基因表达水平的关系。

1.3 细胞株来源

人乳腺癌细胞株MCF-7、T47D、BCAP37、SKBR3及正常乳腺细胞株MCF10A均购自美国菌种保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。所有细胞均接种于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基（美国Thermo Fisher Scientific公司）中，37 ℃、5%CO2培养箱中培养。按LI等[7]报道的方法构建TAM耐药MCF-7细胞株（MCF-7/TAM）：将TAM溶于甲醇中，配置成终浓度为50 mg/mL的溶液，MCF-7细胞用含1 μmol/L TAM的RPMI-1640培养基培养，持续培养6个月。后续为了维持细胞对TAM的耐药表型，将细胞培养于含0.5 μmol /L TAM的培养基中。

1.4 主要试剂

TAM（美国Sigma公司），NKX2-5抗体（武汉博士德生物工程公司），生物素标记的山羊抗小鼠IgM抗体（二抗）（北京博奥森生物技术有限公司），兔抗人细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）、磷酸化细胞外调节蛋白激酶（phosphorylatedextracellular regulated protein kinase，p-ERK）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（phosphorylated-p38 mitogenactivated protein kinase，p-p38MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、磷酸化c-Jun氨基末商激酶（phosphorylatedc-Jun N-terminal kinase，p-JNK）抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），鼠抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司），Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司）。

1.5 癌组织和癌旁组织样本中NKX2-5的表达

所有组织样本均用中性甲醛固定，石蜡包埋后制成厚度为3 μm的切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。加入0.1%过氧化氢，室温孵育15 min，消除内源性过氧化物酶，微波修复抗原，5%羊血清封闭10 min。滴加NKX2-5抗体，4 ℃孵育过夜，再滴加生物素标记的二抗，室温孵育1 h。二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，中性树胶封固，CX41型光学显微镜（日本Olympus光学工业株式会社）下观察。根据阳性细胞比例和染色强度，采用半定量评分法对免疫组化染色结果进行评价。染色强度：无染色记0分，轻度染色记1分，中度染色记2分，重度染色记3分。阳性细胞百分比：无阳性细胞为0分，阳性细胞百分比＜10%记1分，阳性细胞百分比为10%～50%记2分，阳性细胞百分比＞50%记3分。最终评分为染色强度得分×阳性细胞百分比得分。

1.6 NKX2-5过表达和抑制

NKX2-5过表达质粒（Ad-NKX2-5）、空载质粒（Ad-NC）及NKX2-5小干扰RNA质粒（NKX2-5-siRNA）、空白对照（NC-siRNA）由上海吉玛生物制药有限公司合成。NKX2-5-siRNA序列为：5'-GCAGCUUCACCUAUCCGAU-3'，NC-siRNA序列为3'-CGUCGAAGUGGAUAGGCUA-5'。采用瞬时转染技术将Ad-NKX2-5、Ad-NC转染MCF-7/TAM细胞（Ad-NKX2-5组、Ad-NC组），将NKX2-5-siRNA、NC-siRNA转染MCF-7细胞（NKX2-5-siRNA组、NC-siRNA组）。采用Lipofectamine 2000脂质体瞬时转染过表达质粒和低表达质粒，具体步骤：将细胞接种于6孔板，加入200 μL Lipofectamine 2000和4 μg质粒，室温避光孵育20 min，37 ℃、5%CO2条件下培养6 h后更换培养基，继续培养48 h后检测转染后的蛋白表达，验证转染效率。

1.7 细胞增殖活力的检测

取处于对数生长期的细胞，用不含胎牛血清的培养液重悬，细胞计数为1.0×104个/mL。将细胞接种于96孔板（100 μL/孔），分别用5、20、50、100 μmol/L TAM处理，连续培养72 h，采用CCK-8试剂盒检测培养24、48、72 h时各孔的吸光度（A）值，计算并绘制细胞在不同浓度TAM下的增殖抑制曲线，各组实验平行重复3次，取平均值。增殖抑制率=（对照组A值-实验组A值）/（对照组A值-空白组A值）×100%。

1.8 乳腺癌细胞中各种蛋白的表达

收集Ad-NKX2-5组、Ad-NC组、NKX2-5-siRNA组和NC-siRNA组细胞，加入1 mL RIPA裂解液，冰浴上裂解20 min，4 ℃ 16 110×g离心15 min，吸取上清液，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白测定试剂盒检测蛋白纯度。取50 μg总蛋白，用10%十二磺基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离。分别加入NKX2-5抗体（1∶1 000）、ERK抗体（1∶1 000）、p-ERK抗体（1∶1 000）、P38抗体（1∶1 000）、p-P38抗体（1∶1 000）、JNK抗体（1∶1 000）、p-JNK抗体（1∶1 000）和GAPDH抗体（1∶2 000），4 ℃孵育过夜。次日用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）冲洗3遍，滴加二抗稀释液（1∶4 000），37 ℃孵育2 h。加入增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）液显色，采用LAS4000mini超灵敏化学发光成像仪拍照。以GAPDH为内参，计算目的蛋白的相对表达量。

1.9 人乳腺癌细胞株MCF-7、T47D、BCAP37、SKBR3、MCF10A中NKX2-5 mRNA的表达及正常乳腺细胞株

采用逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）检测MCF-7、T47D、BCAP37、SKBR3、MCF10A细胞中NKX2-5 mRNA的表达。采用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，并用HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒将0.5 μg总RNA逆转录为互补DNA（complementary DNA，cDNA）。取1 μL cDNA产物进行聚合酶链反应（ploymerase chain reaction，PCR）扩增。NKX2-5：5'-CGGACCACCTCGCCTTACA-3'（正义链），5'-CTGGGCTCCTTCCCTCATCG-3'（反义链）；GAPDH：5'-TGCACCACCAACTGCTTAG-3'（正义链），5'-AGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3'（反义链）。反应条件：95 ℃45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30个循环。以GAPDH为内参，按2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.10 统计学方法

采用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析。呈正态分布的数据以±s表示，2个组之间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两之间比较采用LSD-t检验。绘制Kaplan-Meier生存曲线，组间比较采用Log-rank检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织样本中NKX2-5的表达

免疫组化染色结果显示，NKX2-5主要表达于细胞质，阳性细胞颜色为棕黄色或褐色。癌旁组织NKX2-5的阳性表达率为74.0%（37/50），癌组织为42.0%（21/50），癌旁组织NKX2-5表达明显高于癌组织（P＜0.05）。TAM敏感组织中NKX2-5表达明显高于TAM耐药组织（P＜0.05）。见图1。

图1 不同组织中NKX2-5的表达（×200）

表1 乳腺癌患者的一般资料

本研究50例乳腺癌患者和GEO数据库104例乳腺癌患者的临床资料见表1。

癌旁组织NKX2-5的评分明显高于乳腺癌组织（P＜0.000 1）。TAM敏感组织NKX2-5的评分明显高于TAM耐药组织（P＜0.000 1）。见图2。

NKX2-5高表达率为78.8%（82/104），NKX2-5低表达率为21.2%（22/104）。Kaplan-Meier生存曲线结果显示，NKX2-5低表达组总生存率和无复发生存率明显低于NKX2-5高表达组（P＜0.000 1）。在接受TAM治疗的乳腺癌患者中，NKX2-5低表达组总生存率明显低于NKX2-5高表达组（P＜0.000 1）。见图3。

图2 不同组织免疫组化染色评分比较

图3 NKX2-5高表达和低表达乳腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲线

2.2 人乳腺癌细胞株MCF-7、BCAP37、T47D、SKBR3及正常乳腺细胞株MCF10A中NKX2-5的表达

与MCF10A细胞相比，MCF-7细胞NKX2-5 mRNA和蛋白表达明显升高，T47D、BCAP37、SKBR3细胞明显降低（P＜0.05），见图4。采用不同浓度TAM处理MCF-7、T47D、BCAP37及SKBR3细胞，结果显示TAM对MCF-7细胞的半数抑制浓度（half inhibit concentration，IC50）低于T47D、BCAP37及SKBR3细胞，见表2。

由于MCF-7细胞NKX2-5的表达量相对较高，因此后续实验均选择MCF-7细胞作为研究对象。与MCF-7细胞比较，MCF-7/TAM细胞NKX2-5蛋白表达降低（P＜0.05），见图5。

图4 MCF-7、T47D、BCAP37、SKBR3及MCF10A细胞NKX2-5蛋白及NKX2-5 mRNA的表达

表2 不同浓度TAM对MCF-7、T47D、BCAP37、SKBR3细胞的增殖抑制率 %，x±s

图5 MCF-7和MCF-7/TAM细胞NKX2-5蛋白表达的比较

TAM对MCF-7细胞的IC50低于MCF-7/TAM细胞，见表2。MCF-7和MCF-7/TAM细胞的NKX2-5蛋白表达均呈浓度依赖性降低，见图6。

2.3 NKX2-5表达对TAM敏感性的影响

Ad-NKX2-5组NKX2-5蛋白表达明显高于Ad-NC组（P＜0.05），NKX2-5-siRNA组蛋白NKX2-5蛋白表达明显低于NC-siRNA组（P＜0.05），见图7。提示质粒转染成功。

图6 不同浓度TAM处理后MCF-7和MCF-7/TAM细胞NKX2-5蛋白表达的比较

采用50、100 μmol/L TAM处理后，Ad-NKX2-5组增殖抑制率明显高于Ad-NC组（P＜0.05），NKX2-5-siRNA组增殖抑制率明显低于NC-siRNA组（P＜0.05）。见表3。

2.4 NKX2-5对MAPK信号通路的影响

MCF-7/TAM细胞p-P38、p-JNK、p-ERK蛋白表达明显高于MCF-7细胞（P＜0.05），见图8。

Ad-NKX2-5组p-P38、p-JNK、p-ERK蛋白表达明显低于Ad-NC组（P＜0.05），NKX2-5-siRNA组p-P38、p-JNK、p-ERK蛋白表达明显高于NC-siRNA组（P＜0.05）。见图9。

图7 Ad-NKX2-5组、Ad-NC组、NKX2-5-siRNA组和NC-siRNA组NKX2-5蛋白的表达

表3 不同浓度TAM对Ad-NKX2-5组、Ad-NC组和NKX2-5-siRNA组、NC-siRNA组的增殖抑制率%，

表3 不同浓度TAM对Ad-NKX2-5组、Ad-NC组和NKX2-5-siRNA组、NC-siRNA组的增殖抑制率%，

注：与Ad-NC组比较，*P＜0.05；与NC-siRNA组比较，#P＜0.05

images/BZ_59_197_1072_1117_1204.pngAd-NKX2-5组 8.7±0.521.4±5.7 56.9±10.1*67.9±7.8*Ad-NC组 4.3±0.419.7±4.5 28.9±7.3 49.7±7.1 NKX2-5-siRNA组19.8±5.438.9±6.2*#40.9±5.4*# 40.5±5.6*#NC-siRNA组 21.2±6.559.4±8.4 60.1±8.9 67.7±7.6

图8 MCF-7细胞和MCF-7/TAM细胞MAPK信号通路相关蛋白的表达

图9 Ad-NKX2-5组、Ad-NC组、NKX2-5-siRNA组和NC-siRNA组MAPK信号通路相关蛋白的表达

3 讨论

内分泌治疗药物耐药是ER阳性乳腺癌患者临床治疗的难点之一，耐药的产生会影响内分泌治疗的效果和患者的远期生存率[8]。本研究分析了从GEO数据库中获取的相关数据，结果显示NKX2-5低表达组总生存率和无复发生存率明显低于NKX2-5高表达组，在接受内分泌药物治疗的乳腺癌患者中，NKX2-5低表达与总生存率有关，提示NKX2-5可能是乳腺癌的一种抑癌基因，或可作为乳腺癌预后评估的指标之一。同时，本研究临床样本的检测结果显示，乳腺癌组织NKX2-5表达降低，TAM耐药患者的癌组织中NKX2-5表达也同样降低，提示NKX2-5可能与乳腺癌TAM耐药有关。

既往研究结果显示，NKX2-5与心肌细胞的发育有关[9-10]。NKX2-5可激活α-肌动蛋白等心肌转录因子，在胚胎时期心肌组织定向分化过程中起关键作用[11]。近期有学者发现前列腺癌组织NKX2-5表达下调，NKX2-5可能通过表观遗传DNA甲基化改变抑制前列腺癌的早期病变[12]。还有研究结果显示，肺癌血清NKX2-5水平明显升高，NKX2-5高表达与患者的不良结局有关[13]。这说明NKX2-5表达可能存在组织特异性，在不同肿瘤中发挥的作用也不一样。目前，尚未见NKX2-5与恶性肿瘤化疗耐药的相关报道。杨莉[14]的研究结果显示，NKX2-5的同型家族成员NKX2-1与肺癌化疗药物的耐药有关，NKX2-1高表达的肺癌细胞对吉西他滨的敏感性高于顺铂及多西他赛。本研究结果显示，TAM对MCF-7细胞的IC50明显低于MCF-7/TAM细胞，且MCF-7/TAM细胞NKX2-5蛋白表达明显低于MCF-7细胞。提示NKX2-5可能参与了乳腺癌细胞TAM耐药的发生。

本研究采用瞬时转染技术上调MCF-7/TAM细胞和下调MCF-7细胞中NKX2-5的表达，结果显示，上调MCF-7/TAM细胞NKX2-5表达可以明显增强TAM对MCF-7细胞的抑制作用，而下调MCF-7细胞NKX2-5表达则可降低MCF-7细胞对TAM的敏感性。说明NKX2-5可以逆转乳腺癌细胞对TAM的耐药性。ALCÁNTARA-ORTIGOZA等[15]分析了癌症基因组数据库，发现肺癌、乳腺癌等组织中缺乏NKX2-5；敲除NKX2-5基因后可激活SOX2和KRAS 2种癌基因，诱导组织出现恶性病变，并介导癌细胞逃避化疗和药物治疗。LI等[16]的研究结果显示，TAM可以上调NKX2-1表达，在TAM耐药的细胞株中上调NKX2-1可以增加细胞对TAM的敏感性。本研究初步证实NKX2-5是一种抑癌因子，并可增加TAM耐药乳腺癌细胞对TAM的敏感性。

内分泌治疗药物耐药的产生是一个复杂的过程，有多种信号通路和调控机制参与其中。ERK、JNK和p38MAPK信号通路是生物体内存在的一条经典信号通路[17]。MAPK通路可将细胞外信号转导至细胞核内，并引起细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学反应[18]。XU等[19]的研究结果显示，阻断MAPK信号通路可以抑制乳腺癌细胞增殖，激活此信号通路则可降低乳腺癌细胞对TAM的敏感性。既往研究证实TAM耐药乳腺癌细胞中活化型ERK明显增加，p-P38MAPK表达增加与MCF-7细胞TAM耐药有关[20-21]。本研究结果显示，与MCF-7细胞比较，MCF-7/TAM细胞p38MAPK、JNK、ERK的活化型蛋白（p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK）表达明显增加，提示TAM耐药细胞中MAPK信号通路处于激活状态，TAM耐药可能与MAPK信号通路活化有关。上调MCF-7/TAM细胞NKX2-5表达可以抑制MAPK通路，而下调MCF-7细胞NKX2-5表达则可激活MAPK通路，提示NKX2-5可能是通过抑制MAPK信号通路逆转MCF-7细胞对TAM的耐药。

综上所述，TAM耐药乳腺癌细胞中NKX2-5表达下调。上调NKX2-5表达或许能通过抑制MAPK信号通路逆转MCF-7细胞对TAM的耐药。NKX2-5有望成为TAM耐药乳腺癌的潜在治疗靶点。