张广雨，胡志明，褚德朋，戴永平，尹绍静，严明雄，段焰，孙康，Naila Ilyas，尤祥伟，李义强

1 中国农业科学院烟草研究所，山东省青岛市崂山区科苑经四路11号 266101；

2 云南省烟草公司保山市公司，云南省保山市隆阳区正阳北路186号 678000；

3 湖南农业大学植物保护学院，长沙市芙蓉区农大路1号 410128

烟草青枯病 是我国烟区普遍发生的重要土传性维管束病害，病原菌茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum），具有趋化性、运动性和广泛的寄主范围，发病初始部位一般在根部，适宜的环境条件下扩展迅速，可造成烟叶减产低质甚至绝收[1-3]。生物炭是生物质在完全或部分缺氧的条件下经热解得到的一种稳定的、高度芳香化的、富含碳的固体材料，具有孔隙多、比表面积大、含氧官能团丰富的特征，具有提高土壤pH、改善土壤养分和理化结构、提高微生物多样性和促进植物生长的功效[4-5]。生物炭在防治土传病害方面也具有应用前景，有研究表明，施用生物炭能减少烟草黑胫病、番茄青枯病、西瓜枯萎病等病害的发生[6-8]，但对防控烟草青枯病及其机制的研究较少。基于此，本文结合室内实验和盆栽试验，研究了生物炭对青枯菌生长、运动性及吸附作用的影响，以及生物炭对土壤理化性质和细菌群落结构多样性的影响，以期为生物炭防控烟草青枯病提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烟草品种为小黄金1025，供试菌株为烟草青枯菌1 号生理小种生物型Ⅲ，由中国农业科学院烟草研究所植物保护中心提供。供试土壤为烟田土壤与育苗基质（m : m=7:3）混合后的土壤，取自中国农业科学院烟草研究所即墨试验基地，基本理化性质为：pH 5.26，有机质107.79 g/kg，速效磷1.95 mg/kg，速效钾308.44 mg/kg，硝态氮114.03 mg/kg，铵态氮239.63 mg/kg。供试生物炭为松木生物炭（研磨后过0.12 mm 筛），在450℃厌氧条件下慢速热解6 h 制成，购自青岛贝尔卡环境生物工程有限公司，其理化性质如表1 所示。

表1 生物炭基本理化性质Tab. 1 Physical and chemical properties of biochar

1.2 生物炭对青枯菌的影响

1.2.1 生物炭对青枯菌生长的影响

采用稀释平板计数法[9]测定不同生物炭添加量对青枯菌生长的影响。向加有不同生物炭含量的NB 液体培养基（生物炭：NB 培养基；m : v =0/0.5/1.5/3/5 : 100）中接种等量稀释的青枯病菌悬液（浓度为3×108cfu/mL）， 分 别 为 BC0（CK）、BC0.5、BC1.5、BC3、BC5 处理，每处理3 次重复，NB 培养基pH：7.0±0.2。30℃下震荡培养12 h，各处理培养液经逐级稀释9 个梯度后，吸取10 μL 涂布于含有TTC 的NA 培养基上，30℃培养32 h，取适宜记录的最低稀释倍数平板进行计数。

每毫升菌落形成单位（cfu/mL）=同一稀释度的平均菌落数×稀释倍数×100

1.2.2 生物炭对青枯菌的吸附作用和运动性的影响

将3×108cfu/mL 青枯菌悬液与生物炭混合，制备成0、0.5%、1.5%、3%、5%（生物炭：菌悬液；m : v）不同生物炭含量的菌悬液。取5 mL 转移到离心管，30℃、90 r/min 震荡孵育60 min，静置60 min。取孵育后上清液，用无菌水10 倍梯度稀释9 个梯度，吸取10 μL 各梯度样品涂布于含TTC 的NA 培养基上，30℃培养24 h 后记录各梯度菌落数，研究吸附作用[9]，计算方法同1.2.1。运动性测定参照谷益安[9]和李石力[10]相关研究方法：吸取2.5 μL 孵育后的菌液，垂直滴于半固体SMM 培养基（0.35%琼脂）上，30℃恒温培养32 h 后测定每个平板上3 个菌落的直径，取平均值，每个处理3 次重复。

运动性=测量直径（mm）-起始接菌直径（mm）

1.3 生物炭对烟草生长及根际细菌群落多样性的影响

该试验在温室中进行，添加不同量生物炭，制备成0、0.5%、1.5%、3%、5%（生物炭：土壤，m : m）不同生物炭含量的土壤，每盆1 kg 土。烟苗培育到大十字期后，用无菌水小心漂洗根部，移栽于不同生物炭含量的土壤中，每处理4 次重复。在移栽后30 d、60 d，调查烟株主要农艺性状，包括株高、叶数、最大叶长和最大叶宽。移栽60 d 后，抖根法收集根际土壤样品，保存至-80℃，用于根际微生物群落结构多样性的测定；四分法收集所有土壤样品，风干后用于理化性质的测定。

根际土壤微生物基因组总DNA 采用E.Z.N.A.® soil DNA kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）试剂盒提取。使用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’） 和 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’） 对 16S rRNA 基因V3-V4 区进行扩增。PCR 反应条件：95℃3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，30 个循环；72℃ 延伸10 min。PCR 产物经纯化、检测、定量后使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 进行建库。测序工作由上海美吉生物医药科技有限公司利用Illumina公司的MiseqPE300 平台完成。

1.4 生物炭对烟草青枯病的防效试验

盆栽试验在温室进行。烟苗培育到大十字期后，用无菌水小心漂洗根部，分别移栽于0、0.5%、1.5%、3%、5%不同生物炭含量的土壤中，每处理15株，3 次重复。待烟苗定植10 d 后，采用灌根法接种，每株接种3×108cfu/mL 的青枯菌悬液30 mL，接种后每天观察烟苗发病情况，直至对照处理发病率超过80%，参照烟草病虫害分级及调查方法[11]进行病害分级，计算发病率、病情指数和防治效果，并按照四分法收集土壤样品，于-80℃保存。

发病率= （发病株数/调查总株数）×100%

病害指数= [∑（各级病株×该病级值）/（调查总株数×最高级值）] ×100

防治效果= （对照处理病情指数-处理病情指数）/ 对照处理病情指数×100%

1.5 土壤理化性质测定及其与烟草青枯病发生的相关性分析

将土壤样品风干过筛，采用水浸提法测定土壤pH；重铬酸钾外加热法测定土壤有机质；氯化钾浸提流动分析仪测定硝态氮铵态氮；碱解扩散法测定碱解氮；钼锑抗比色法测定速效磷；火焰光度法测定速效钾[12]。使用统计学软件进行土壤理化性质和青枯病发病率、病情指数的Pearson 相关性分析。

1.6 数据处理

测序数据按照97%的相似性聚类成OTU，采用Usearch（vsesion 7.0 http://drive5.com/uparse/）软件平台和RDP classifier 贝叶斯算法进行分析，在各个分类水平统计各样本的群落组成。细菌16S rRNA 测序使用silva 数据库（Release132 http://www.arb-silva.de）。使用SPSS 17.0 统计软件进行单因素方差分析和相关性分析，采用Duncan 新复极差法进行多重比较（P ＜0.05）。

2 结果

2.1 生物炭对青枯菌的影响

2.1.1 生物炭对青枯菌生长的影响

青枯菌在含有TTC 的NA 培养基上的试验结果显示（图1、图2），生物炭对烟草青枯菌的生长有一定的抑制作用，这种抑制作用具有浓度依赖性，生物炭用量超过1.5%时抑制作用显著，其中5%的生物炭处理效果最好，与对照处理相比，青枯菌浓度降低了14.51%。

图1 不同生物炭添加量处理的青枯菌浓度Fig. 1 Concentrations of Ralstonia solanacearum under different dosages of biochar

图2 不同生物炭添加量处理中青枯菌菌落数（稀释105 倍）Fig. 2 The number of Ralstonia solanacearum colonies under different dosages of biochar (Diluted 105 times)

2.1.2 生物炭对青枯菌的吸附作用及其运动性的影响

含有生物炭的菌悬液培养后，取上清液接种到含TTC 的NA 培养基上的试验结果显示（图3、图4），生物炭具有吸附青枯菌的能力，且用量越大吸附作用越明显，稀释104倍的青枯菌，用1.5%、3%和5%的生物炭处理，其菌落数量显著降低，与对照处理相比分别减少了5.56%、7.86%和13.75%。通过测定青枯菌群落运动直径探究生物炭对青枯菌运动性的影响，结果如图5 所示，在添加量0.5%时，生物炭就可以显著降低青枯菌运动的范围半径，且在0.5%～5%范围内，添加量和抑制运动能力成正比，生物炭的添加量越大，青枯菌运动性越弱。

2.2 生物炭对烟草青枯病的防效试验

2.2.1 生物炭对烟草青枯病发生的影响

图3 不同生物炭添加量的青枯菌浓度Fig. 3 Concentrations of Ralstonia solanacearum under different dosages of biochar

发病情况结果如表2 所示，接种13 d 后，CK 发病率超过80%，但施用生物炭处理的青枯病发病率和病情指数均有所降低。随着生物炭用量增加，发病率和病情指数越低，防效在2.53%～81.38%之间，以BC3 和BC5 处理防效较好，其相对防效分别为78.73%和81.38%。

图4 不同生物炭添加量对青枯菌的吸附作用（稀释104 倍）Fig. 4 Adsorption of Ralstonia solanacearum under different dosages of biochar (Diluted 104 times)

图5 不同生物炭添加量处理青枯菌的运动性Fig. 5 Motility of Ralstonia solanacearum under different dosages of biochar

2.2.2 生物炭对土壤理化性质的影响及其与青枯病发生的相关性

不同生物炭含量的土壤种植烟草后的检测结果表明（表3），生物炭处理与对照相比，使用生物炭的土壤pH、速效磷、速效钾含量比对照高，土壤硝态氮和铵态氮的含量比对照低，其中BC3、BC5各指标差异均达显著水平。相关性分析结果如表4所示，土壤理化指标与烟草青枯病的病情指数和发病率有极显著或显著的相关性，且其相关系数大于0.6，其中硝态氮和铵态氮含量与病情指数及发病率呈正相关，pH、有机质、速效磷和速效钾含量呈负相关。

表2 盆栽防效试验中不同生物炭添加量对烟草青枯病防治效果的影响Tab. 2 Control effects of different dosages of biochar on tobacco bacterial wilt in pot experiment

表3 盆栽防效试验中不同处理土壤理化性质Tab. 3 Physicochemical properties of soil under different treatments in pot experiment

表4 盆栽试验中环境因子与烟草青枯病发病情况的皮尔逊相关系数Tab. 4 Pearson correlation coefficient between environmental factors and incidence of tobacco bacterial wilt in pot experiment

2.3 生物炭对烟草生长的影响

添加生物炭对烟草的农艺性状有较明显的改善作用。由表5、图6 可知，移栽30 d 后，BC3、BC5 处理株高较CK 显著增加，不同用量生物炭均能显著提高有效叶数而对最大叶长无影响；移栽60 d 后，各处理长势差距缩小，以BC5 处理长势最好。

表5 盆栽试验中不同处理烤烟农艺性状Tab. 5 Agronomic characters of flue-cured tobacco under different treatments in pot experiment

2.4 生物炭对根际土壤细菌群落结构多样性的影响

2.4.1 根际土壤细菌多样性分析

烟苗移栽60 d 后，对施用不同含量生物炭各处理的根际土壤样品微生物群落的Alpha 多样性进行评估，结果如表6 所示。各处理覆盖率为98.77%～99.15%，说明所建的MiSeq 文库覆盖了土壤样品中98.77%以上细菌，能够反映样品中细菌的真实组成。BC5 处理显著提高了Shannon 指数，其他生物炭处理较对照差异不显著。Chao 指数、Ace 指数，生物炭处理较对照有所提升，以BC5 处理效果显著。表明生物炭可以提高土壤细菌的群落丰富度和多样性，以5%用量生物炭处理效果最明显。

图6 不同生物炭添加量处理对烟草生长的影响Fig. 6 Effects of different dosages of biochar on tobacco growth

表6 不同处理下根际土壤细菌的Alpha 多样性指数Tab. 6 Alpha diversity index of rhizosphere soil bacteria under different treatments

2.4.2 根际土壤细菌群落组成分析

在门水平上（图7 a），不同试验处理中优势细菌类群（相对丰度大于2%）按丰度大小排序为：放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、Patescibacteria、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、厚壁菌门（Firmicutes）。生物炭的添加使细菌门水平丰度发生了变化，其中放线菌门（Actinobacteria）变化最明显，较对照提高了12.07～38.56%。

在属水平上（图7 b），各处理根际土壤中链霉菌属（Streptomyces）相对丰度最高，占29.47～49.01%，生物炭处理中该菌相对丰度是对照的1.25～1.66 倍，以BC3处理丰度最高。生物炭还提高了根瘤菌（Rhizobium）、Microscillaceae 的相对丰度，而Saccharimonadales、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）、芽单胞菌（Gemmatimonas）在生物炭处理中相对丰度有所降低。

2.4.3 环境因子关联分析

由图8 可见， BC5、BC3 和CK 的土壤样品可以明显区分，说明3%和5%用量的生物炭对土壤微生物群落产生了较大影响。添加不同量的生物炭后，有效钾的变化对样品中细菌群落结构多样性的影响最大，其次是硝态氮、pH、有效磷、铵态氮和有机质。从图中箭头分布可看出，生物炭对土壤理化性质的改良是导致其细菌群落结构变化的主要因素。

3 讨论

生物炭作为一种土壤改良剂，对土壤理化性质的改善有显著效果。试验结果表明，生物炭提高了土壤pH、速效磷和速效钾含量，降低了硝态氮和铵态氮含量，主要原因是生物炭呈碱性，表面带负电荷的官能团可吸附土壤中H+，可提高土壤pH[13]；生物炭表面所含的化学元素和较高的阳离子交换量，对土壤肥力的提升有促进作用[14]；生物炭的较大比表面积和表面电荷密度，可增强土壤持水保肥能力[15]；硝态氮及铵态氮减少的原因有待于进一步研究。综合来看，生物炭的优异理化特性决定了其对土壤有较好的改良作用。相关性分析表明，病情指数及发病率与硝态氮和铵态氮含量呈正相关，与pH、有机质、速效磷和速效钾含量呈负相关，这与郑世燕[16]的观点一致，由于生物炭富含孔隙且自身含有营养元素，对土壤理化性质有改善作用，减少了烟草青枯病的发生，有利于烟草的生长，盆栽试验表明，5%用量的生物炭对烟草农艺性状的改善效果最为明显，这与邵慧芸[17]和张继旭[18]研究结果类似：前者研究发现烟杆生物炭的添加提高了烟草叶片数、株高和最大叶面积等，促进了烤烟的生长，以0.1%和1.0%效果较佳；后者研究表明，0.2%～1.0%剂量秸秆生物炭提高了烤烟株高、地上部生物量，对烟草有促生作用，与本研究生物炭能促进烟草生长的结果一致，而最佳剂量却有所差异，这可能是因为生物炭的来源及性质不同造成的。

图7 不同处理下细菌在门（a）和属（b）水平的主要群落组成Fig. 7 Main community composition of bacteria at phylum level(a)and genus level(b) under different treatments

图8 环境因子与属水平上细菌优势类群的冗余分析Fig. 8 Redundancy analysis of environmental factors and bacterial dominant groups at genus level

生物炭对根际微生态的调控也有较显著的作用。根际土壤细菌Alpha 多样性评估发现，Shannon 指数、Chao 指数、Ace 指数生物炭处理较对照有所提升，以BC5 处理效果最显著，说明生物炭提高了根际土壤微生物群落结构的Alpha 多样性，这与姜桦韬[19]研究结果相似。放线菌作为重要的益生菌对植物生长及防控病害均有一定效果[20-21]，根际土壤细菌群落组成分析发现，链霉菌属为代表的放线菌相对丰度最高，且生物炭处理提高了该菌丰度，对青枯菌有较好的抑制作用[22]，这可能是生物炭利于烟草生长和减少青枯病发生的原因。生物炭处理后，Saccharimonadales、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）、芽单胞菌（Gemmatimonas）的减少，可能是由生物炭的吸附作用和对土壤微生态的改变所致。微生物多样性的降低是土传病害发生的重要原因[23]，生物炭对细菌结构多样性的提高可能使其对烟草青枯病具有防控效果，盆栽防效试验验证了这一猜想，结果表明生物炭明显降低了发病率和病情指数，这与李成江[24]、饶霜[25]的研究结果一致。当然，根际土壤微生态与土壤理化性质也存在相关性。添加不同量的生物炭后有效钾含量的变化，对根际土壤中细菌多样性的影响最大，然后依次是硝态氮、pH、有效磷、铵态氮和有机质，说明生物炭对土壤理化性质的改良是导致其细菌群落结构变化的主要因素，这与施河丽[23]的观点一致。

生物炭对青枯菌的抑制作用，也对控制青枯病有一定作用。室内实验结果表明，生物炭具有吸附青枯菌、抑制青枯菌生长和运动性的能力。生物炭对青枯菌的吸附作用是因为生物炭发达的孔隙结构和大比表面积赋予其良好的吸附性能，可直接吸附病原菌，以及通过吸附根际分泌物间接吸引病原菌，降低了病原菌对植株的侵染[9]。生物炭对青枯菌生长的抑制作用是由于青枯菌适宜在pH 6.6 的偏酸性环境中生长[3]，而呈碱性的生物炭可提高环境pH，另外，生物炭可吸附根际分泌物等养分物质[9]，提高微生物间的竞争作用，进而影响青枯菌的数量。运动性是微生物寻找寄主植物及在其根部定殖的前提，生物炭显著降低了青枯菌运动的范围半径，表明生物炭可以抑制青枯菌的运动扩散，减少青枯病的发生。王贻鸿[3]研究表明青枯菌在pH 6.5 的环境中运动性较强，此后随着pH 的升高青枯菌的运动性减弱，说明生物炭对pH的提升，导致青枯菌活动受限，致使病害减轻。

4 结论

生物炭对烟草青枯病有良好的防治效果，其防控机理为：（1）生物炭改善了土壤理化性质，利于烟草的生长，适当提升土壤肥力及土壤pH 是控制烟草青枯病的重要途径。（2）生物炭提高了土壤细菌群落结构多样性，增加了对青枯菌有抑制作用的放线菌门中链霉菌属的丰度。（3）生物炭对青枯菌有抑制作用，能吸附青枯菌、减弱其运动并抑制青枯菌的生长，从而降低青枯菌的侵染能力。