王 烁, 谢丽霞, 陈 浩, 吴光安, 周 浩, 王 瑜,于 毅, 郑 礼, 翟一凡,*, 闫 毅,*

(1. 山东农业大学植物保护学院昆虫学系, 山东泰安 271000; 2. 山东省农业科学院植物保护研究所, 济南 250100)

设施蔬菜是我国农业的主要支柱产业和农民增收的重要途径，但由于设施环境相对封闭和特殊，果类蔬菜缺乏授粉媒介，仅能人工辅助授粉。目前种植户主要采用2,4-D丁酯类激素人工喷花或蘸花，该方法耗时费工，易产生畸形果，还造成激素残留，严重影响果菜的质量安全，导致部分果菜类蔬菜产品的销售、出口受限，降低了农民的收益。随着需要授粉的作物不断增多，需要商业化授粉蜜蜂的数量也随之增多。20世纪80年代，地熊蜂在欧洲商业化生产且被用以取代高昂的机械授粉(Trilloetal., 2019)。

地熊蜂Bombusterrestris属于膜翅目(Hymenoptera)蜜蜂总科(Apoidea)熊蜂属Bombus。地熊蜂应用范围广泛，在全世界熊蜂种类商业化应用最为成熟，全球范围内均有应用(周浩等, 2016)。熊蜂是一类多食性社会性昆虫，是多种虫媒植物特别是豆科、茄科及一些濒危植物的重要授粉者(黄家兴等, 2007)。相较于其他传粉昆虫，熊蜂有着体型大、绒毛多、飞行速度快、适应性强、耐低温及在阴天也能授粉等优点(王欢等, 2019)。使用熊蜂授粉不但省工省力，减少劳动强度，而且可避免因使用激素所致的畸形果，防止激素残留，显著提高果菜产品的质量安全和商品性能。同时熊蜂具有对高风险化学农药的高敏感性，常作为设施果菜种植环境的指示生物。目前，欧盟国家已普遍使用熊蜂授粉技术。随着我国消费者对安全优质农产品的需求日益提高，以及政府对农产品质量安全监管力度的加强，我国设施果菜生产过程中，使用熊蜂授粉技术的面积也在逐年扩大。

新烟碱类杀虫剂属于氯化烟酰杀虫剂，是目前最大的杀虫剂类型之一(Simon-Delsoetal., 2015)，是继拟除虫菊酯类杀虫剂之后又一重大突破(ERSA, 2012)。其具有独特新颖的作用方式、良好的根部内吸性、高效、广谱和对环境相容性好等特点，被广泛用于防治褐飞虱和烟粉虱等刺吸式口器害虫以及部分鞘翅目和鳞翅目害虫(Tomizawa and Casida, 2003),一经上市便成为市场发展最快、销售最成功、效果最出色的一类杀虫剂。其作用靶标为乙酰胆碱受体，因昆虫的受体与哺乳动物受体存在差异，使得新烟碱类杀虫剂对昆虫毒性较高而对哺乳动物毒性较低，对人畜安全性较高(Millar and Denholm, 2007)。但由于其作用机制对蜜蜂有着较大的杀伤性，使新烟碱药剂一度陷入禁用风波之中。为保护授粉昆虫，欧盟于2018年禁止在户外使用噻虫胺、噻虫嗪和吡虫啉3种新烟碱杀虫剂(Codlingetal., 2018)。目前国内已对蜜蜂的生态风险性进行了系统的评估(赵怡楠等, 2014)，但缺少新烟碱类杀虫剂对熊蜂的生态风险评估。为了明确新烟碱类杀虫剂对地熊蜂的影响，本试验参照《化学农药环境安全评价试验准则. 第10部分：蜜蜂急性毒性试验》(袁善奎等, 2014)，采用饲喂法和接触法测定新烟碱类杀虫剂对地熊蜂的毒性，并参照欧洲和地中海植物保护组织(EPPO, 2000)所采用的危害熵 (hazard quotient, HQ) 值来对8种新烟碱类杀虫剂的生态风险性进行评估，为温室施用新烟碱类杀虫剂提供科学依据，通过合理的选择新烟碱类杀虫剂来减轻或避免地熊蜂在传粉时受到的伤害，同时为我国开展新烟碱类杀虫剂对熊蜂的安全性评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

供试蜂种为地熊蜂工蜂，购自山东鲁保科技开发有限公司，于温度25±2℃、相对湿度60%±10%、黑暗条件下进行饲养，饲养过程未接触化学农药和试剂。试验所用地熊蜂均为个体大小基本一致的健康成年工蜂。

1.2 供试药剂

供试药剂为25%噻虫嗪水分散粒剂[先正达(中国)投资有限公司]、20%噻虫胺悬浮剂(江苏辉丰生物农业股份有限公司)、20%啶虫脒可溶粉剂(江苏龙灯化学有限公司)、70%吡虫啉水分散粒剂[拜耳作物科学(中国)有限公司]、20%呋虫胺可溶粒剂(日本三井化学ARGO株式会社)、10%烯啶虫胺水剂(浙江世佳科技有限公司)、2%噻虫啉微囊悬浮剂(山东国润生物农药有限责任公司)、20%氟吡呋喃酮水剂(拜耳作物科学有限公司)。

1.3 新烟碱类杀虫剂对地熊蜂的毒力测定

参考我国《化学农药环境安全评价试验准则. 第10部分：蜜蜂急性毒性试验》(袁善奎等, 2014)，将农药对地熊蜂的毒性划分4个等级(以有效成分计)：低毒(LD50>11.0 μg a.i./ 蜂)；中毒(2.0 μg a.i./蜂

1.3.1急性经口毒性：参照《化学农药环境安全评价试验准则. 第10部分：蜜蜂急性毒性试验》(袁善奎等， 2014)，将各供试杀虫剂母液用50%的蔗糖水溶液稀释成5个浓度梯度，按每头蜂取食20 μL的量在饲喂器中加入不同浓度的药剂200 μL，将饥饿处理2 h的成年工蜂移入蜂笼，每个蜂笼10头成蜂，每个处理重复3次，并设50%蔗糖水为空白对照。饲喂3 h待药剂消耗完后添加充足50%蔗糖水继续饲养，记录24 h和48 h地熊蜂工蜂死亡数，计算地熊蜂工蜂的死亡率。

1.3.2急性接触毒性：参照《化学农药环境安全评价试验准则. 第10部分：蜜蜂急性毒性试验》(袁善奎等, 2014)，用8%吐温-80水溶液配制的母液稀释成5个浓度梯度。用微量点滴仪将不同浓度的供试药剂按每头蜂2 μL点滴在用CO2麻醉后的地熊蜂工蜂的中胸背板上，待蜂身晾干后转入蜂笼中，用充足的50%蔗糖水饲喂，每个蜂笼10头成蜂，每个处理重复3次，并设8%吐温-80水溶液为空白对照。记录24 h和48 h地熊蜂工蜂死亡数，计算地熊蜂工蜂的死亡率。

1.4 新烟碱类杀虫剂对地熊蜂工蜂的生态风险评估

新烟碱类杀虫剂对地熊蜂工蜂的生态风险评估参照欧洲和地中海植物保护组织(EPPO, 2000)所采用的HQ值。HQ值为农药田间推荐用量(AR) (g a.i./hm2)与农药对地熊蜂工蜂急性经口或接触LD50(μg a.i./蜂)值的比值: HQ=AR/LD50。HQ>2 500，高风险; 50

1.5 数据分析

利用统计软件Probit软件对试验内容所得数据进行统计分析，计算得出LD50和LD90值(95%置信区间)，并分析每种农药的毒性等级。根据试验的数据分析喷施农药暴露场景下的风险熵值，并进行生态风险评估。

2 结果

2.1 8种新烟碱类杀虫剂对地熊蜂成年工蜂的急性经口毒性

由表1结果可知，通过饲喂法测得的地熊蜂成年工蜂24 h的LD50值由小到大顺序分别为：噻虫胺<噻虫嗪<烯啶虫胺<呋虫胺<吡虫啉<噻虫啉<啶虫脒<氟吡呋喃酮；48 h的LD50值由小到大顺序分别为：噻虫胺<噻虫嗪<烯啶虫胺<呋虫胺<吡虫啉<噻虫啉<啶虫脒<氟吡呋喃酮。

地熊蜂工蜂急性经口毒性测定结果为噻虫胺毒性最高，氟吡呋喃酮毒性最低。同时，8种新烟碱类药剂24 h的LD50值均大于48 h的LD50值。根据我国《化学农药环境安全评价试验准则. 第10部分: 蜜蜂急性毒性试验》(袁善奎等, 2014)中农药对蜜蜂急性毒性分级标准，8种新烟碱杀虫剂中急性经口毒性除啶虫脒、噻虫啉与氟吡呋喃酮为低毒外，其余5种均为高毒。

2.2 8种新烟碱类杀虫剂对地熊蜂成年工蜂的急性接触毒性

由表2结果可知，通过接触法测得的地熊蜂成年工蜂24 h的LD50值由小到大顺序分别为：噻虫胺<噻虫嗪<呋虫胺<烯啶虫胺<吡虫啉<噻虫啉<啶虫脒<氟吡呋喃酮；48 h的LD50值由小到大顺序分别为：噻虫胺<噻虫嗪<呋虫胺<烯啶虫胺<吡虫啉<噻虫啉<啶虫脒<氟吡呋喃酮。与急性经口毒性结果一致，对地熊蜂工蜂急性接触毒性测定结果为噻虫胺毒性最高，氟吡呋喃酮毒性最低，8种新烟碱类药剂24 h的LD50值均大于48 h的LD50值。同时根据我国《化学农药环境安全评价试验准则. 第10部分: 蜜蜂急性毒性试验》(袁善奎等, 2014)中农药对蜜蜂急性毒性分级标准，8种新烟碱药剂中急性接触毒性除啶虫脒、噻虫啉与氟吡呋喃酮为低毒外，其余5种均为高毒。

表1 8种新烟碱类杀虫剂对地熊蜂成年工蜂的急性经口毒性

毒性等级参照根据中华人民共和国《化学农药环境安全评价试验准则. 第10部分: 蜜蜂急性毒性试验》(袁善奎等, 2014)中农药对蜜蜂急性毒性分级标准The toxicity level is based on the grading standard of the acute toxicity of pesticides to bees in Environmental Safety Assessment Test Criteria for Chemical Pesticides-Part 10: Acute Toxicity Test for Bees (Yuanetal., 2014). 低毒Low toxicity: LD50>11.0 μg a.i./bee; 中毒Moderate toxicity: 2.0 μg a.i./bee

表2 8种新烟碱类杀虫剂对地熊蜂成年工蜂的急性接触毒性

2.3 8种新烟碱类杀虫剂对地熊蜂成年工蜂的生态风险评估

通过饲喂法和接触法测得的48 h的LD50值计算得到8种新烟碱类杀虫剂对地熊蜂成年工蜂的危害熵值(HQ)。8种供试制剂中，啶虫脒、噻虫啉和氟吡呋喃酮的经口与接触危害熵值均小于50，为低风险；吡虫啉、烯啶虫胺、呋虫胺的经口与接触危害熵值均大于50小于2 500，为中等风险；而噻虫嗪与噻虫胺的接触危害熵值均大于2 500，为高风险，但经口危害熵值则在50～2 500之间，为中等风险(表3)。

表3 8种新烟碱杀虫剂对地熊蜂成年工蜂的危害熵值

AR: 推荐的农药单次最高施用量Recommended application rate of a pesticide. 杀虫剂对地熊蜂工蜂的风险评估参照欧洲和地中海植物保护组织(EPPO, 2000)所采用的HQ值。HQ值为农药田间推荐用量与农药对地熊蜂工蜂急性经口或接触 LD50值的比值。The risk assessment of insecticides to the workers ofB.terressisrefers to the HQ values used by the European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO, 2000).HQ value is the ratio of the field recommended dose to the LD50value by oral or direct contact exposure．高风险High risk: HQ>2 500; 中等风险Moderate risk: 50

3 结论与讨论

本试验分别采用了饲喂法和接触法对地熊蜂成年工蜂进行了室内毒力测定，从测定结果来看，所选8种新烟碱类杀虫剂，无论采用饲喂法还是接触法，对地熊蜂成年工蜂的测定结果一致，除啶虫脒、噻虫啉与氟吡呋喃酮为低毒外，其余药剂均为高毒(表1和2)。这表明绝大多数新烟碱类杀虫剂对非靶标生物地熊蜂存在严重影响。同时，测定结果显示噻虫胺的毒性最高，氟吡呋喃酮的毒性最低。基于以上试验结果，我们推断出新烟碱类杀虫剂的作用机理类似，均具有胃毒、触杀、内吸和渗透作用，作用原理也均与乙酰胆碱受体类似，但由于化学结构不同，乙酰胆碱亚基组成不同等原因，最终导致其毒性存在一定差异(袁锐等, 2018)。有研究表明，啶虫脒对蜜蜂的毒性为中毒(季守民等, 2015)，这可能与熊蜂体积比蜜蜂大，造成敏感性更小的原因，但同为体型较小的凹唇壁蜂Osmiaexcavata对啶虫脒则表现出更高的敏感性(袁锐等, 2018)，因此，具体产生不同的原因还有待进一步研究。

此外，本试验风险评估采用的是欧洲标准危害熵值(HQ)来判断风险的高低，而我国风险评估程序则是参照NY/T2882.4-2016《农药登记环境风险评估指南. 第4部分: 蜜蜂》(中华人民共和国农业部, 2016)来进行风险的评估。本试验根据我国风险评估标准，根据农药使用方法确定对蜜蜂暴露的可能性，当根据使用方法不能排除蜜蜂受到农药的暴露时，应根据可能的暴露途径，在相应的暴露场景下进行风险评估。本试验所选农药直接喷施于作物，所以针对喷施场景进行风险评估。

初级风险表征用喷施农药暴露场景的风险熵值(risk entropy value, RQsp)来评估每种化学农药的影响。喷施场景下RQsp为RQsp=AR/(LD50×50)其中AR是推荐的农药单次最高施用量，单位是g a.i./hm2或g农药制剂/hm2，LD50为经口和接触的蜜蜂的半致死剂量，单位为μg a.i./bee或μg农药制剂/蜂。根据中国的实际情况，《农药登记环境风险评估指南. 第4部分: 蜜蜂》规定，若RQsp≤1时，风险可接受；当RQsp>1时，风险不可接受，可进行高级风险评估。由此公式可以算出在喷施场景下8种新烟碱类杀虫剂的风险熵值(RQsp)，其中啶虫脒、噻虫啉和氟吡呋喃酮风险均为可接受，而其余5种药剂均为不可接受。对照本试验采用的欧洲标准，我们可以得出结论，在欧洲风险评估标准中低风险在我国风险评估标准中为可接受，而中等风险和高风险则均为不可接受。通过表3的结果表明，噻虫嗪与噻虫胺对地熊蜂成年工蜂的经口毒性为中等风险，而接触毒性为高风险，分析原因，可能是由于两种药剂触杀能力大于胃毒能力，因此对哺乳动物较为安全，而对于熊蜂的授粉昆虫的危害较大。而其他6种药剂的风险一致，但具体的HQ值大小上也存在不同，说明饲喂法和接触法两种方法进行急性毒性测定时结果存在差异，为保证试验的准确性两种方法应该同时进行。

虽然设施农业上使用熊蜂授粉主要集中在花期，但由于新烟碱类杀虫的强内吸性，使得不同发育时期施用也会对熊蜂授粉产生一定影响。有研究表明，新烟碱类杀虫剂，如噻虫嗪、吡虫啉等在花粉中有残留，会对地熊蜂授粉和发育情况存在潜在影响(Kunzetal., 2015)。由于其在植物体内传导机制尚未明确，已知同为蜜蜂科的意大利蜜蜂Apismelliferaliguistica受新烟碱类杀虫剂影响较大，不宜使用。因此，根据本试验研究结果和参考他人研究结果后，在深入研究总结出其对熊蜂毒性和作用机制之前，尽量不使用新烟碱类杀虫剂防治设施农业害虫。此外，啶虫脒、噻虫啉和氟吡呋喃酮的毒性测定虽为低毒，风险评估亦为低风险，但田间实际生产应用仍需仅需进一步做大田试验验证后方可下定论。氟吡呋喃酮是拜耳公司在欧盟禁用部分新烟碱杀虫剂来防止对蜜蜂危害时研究推出的新烟碱类杀虫剂，在我国登记时间较短，因而对我国蜜蜂、熊蜂、壁蜂等授粉昆虫的影响需要进一步试验研究验证。

目前，关于授粉昆虫的研究大部分集中在意大利蜜蜂，而对于熊蜂的研究较少(黄家兴和安建东, 2018)。有研究表明，大部分新烟碱类杀虫剂对熊蜂的急性毒性较高，但后续的应用问题还需要进一步研究解决。如Stanley等(2015)指出，长期接触新烟碱类杀虫剂会损害熊蜂的记忆学习能力；Harrap等(2019)研究表明，熊蜂善于学习区分有图案的花朵，除了视觉模式外，它们还能区分那些只在气味、表面纹理、温度或静电荷模式上不同的花朵，经训练的熊蜂可在不同的感官模式间传递所学的模式而不需要重新学习。Farooqui (2013)研究发现，由于不合理使用新烟碱类农药使得蜜蜂等授粉昆虫寿命缩短，筑巢、取食等行为发生改变，成为蜂群崩溃综合征(colony collapse disorder, CCD)的主要诱因；CCD研究小组调查了百余种病蜂种群样本，也认为新烟碱药剂具有重大嫌疑(Stokstad, 2007)。此外，由于土地管理的变化导致花卉资源的损失通常被认为是传粉昆虫下降的主要原因，这是因为传粉昆虫如熊蜂等需要依靠丰富的花卉资源和多样化的选择来满足它们的能量需求(Rotheray, 2017)。虽然新烟碱类杀虫剂对蜜蜂等授粉昆虫的亚致死效应研究不断深入(Henryetal., 2012; 蔺哲广等, 2014)，但新烟碱类杀虫剂对熊蜂的慢性毒性以及亚致死效应仍需进一步探究。另外，本研究在药剂选择方面选用了商业制剂，但由于制剂在组成成份、含量、剂型、溶解性上存在一定差异，可能会对毒力测定结果产生一定影响。同时目前仅研究了室内急性毒性试验，而田间实际施药对地熊蜂的影响还需进一步试验验证。当下国内外的蜜蜂、熊蜂等授粉昆虫急性毒性测试技术已经很完善，但慢性毒性测试技术仍处于探究摸索阶段。今后应关注其长远发展，并对新烟碱类杀虫剂的长期慢性毒性开展风险评估。