郝娟 段学粉 郭仰东 张喜春

摘 要 为分析SlMYB-related 2基因的生物学功能及为其抗冷害作用机制提供科学依据，从俄罗斯栽培番茄Bolgogragsky（实验室种质编号25）中克隆SlMYB-related 2基因编码区序列，对其进行生物信息学分析，然后构建基因过表达载体。结果表明，在俄罗斯栽培番茄Bolgogragsky的cDNA中克隆了SlMYB-related 2基因，全长1 248 bp，编码415个氨基酸，并构建了基因过表达载体pBI-SlMYB-related 2。说明SlMYB-related 2基因对番茄冷害有响应，进一步推测其可能影响番茄御冷机制。

关键词 番茄;MYB-related 2;过表达载体;冷害

中图分类号：S641.2 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.32.102

番茄（Solanum lycopersicum）为管状花目茄科番茄屬的一年生或多年生草本植物，受到人们的普遍喜爱，是全世界栽培较为广泛的果菜。番茄是喜温作物，不耐低温，因此由低温胁迫造成的损失尤其严重。近年来，植物低温冷害问题越来越受到人们的关注。

MYB转录因子是指含有MYB结构域的一类转录因子，参与植物的生长发育、次生代谢以及相应的生物胁迫与非生物胁迫。在番茄中，转录因子S1MYBL2抑制了CHI酶的活性，使其下调，导致果皮中类黄酮含量下降，最终使番茄的颜色变为粉红色。在苹果中，MdMYBl、MdMYBl0和MdMYBA通过调节花青素的合成控制果皮和果肉的红色性状[1]。葡萄中VvMYBA2和VvMYBAl与启动子相结合，抑制了花青素的合成，导致葡萄的颜色变为绿色[2]。拟南芥中的Atmyb2在高盐条件下，表达量上升，刺激了干旱基因rd22和AtADHI的表达，增强了拟南芥对干旱的耐受力。在低温胁迫中，拟南芥AtMYB 15对植物的耐低温能力起负调控作用，过表达AtMYB15后，降低拟南芥对低温的耐受力[3]。研究表明，在冷应激下，诱导MdMYB88和MdMYB124作用于CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED1（MdCCA1）的上游和直接通过与其启动子的AACCG基序结合来调节其表达，从而提高苹果细胞的耐寒性[3]。

本试验以番茄基因SlMYB-related 2为研究对象，克隆了基因的CDS区，并通过生物信息学软件分析该基因的保守结构域及蛋白质性质，然后通过构建该基因的过表达载体，进一步探究SlMYB-related 2基因在番茄御冷机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为俄罗斯栽培番茄Bolgogragsky（实验室种质编号25）。大肠杆菌菌株DH5α，PBI121载体来自于实验室保存，DNA marker、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒均购于天根生化科技有限公司;Trizol? Reagent （Ambion）购于美国生命技术公司;TransScript?反转录试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司;PrimeSTAR Max Premix、Xba Ⅰ、Sma Ⅰ、T4 DNA连接酶及各种限制性内切酶均购于宝生物（Takara）工程（大连）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 基因生物信息学分析

在NCBI数据库中进行基因保守域预测，在PlantCARE网站进行启动子分析，利用ExPasy Translate软件推导出SlMYB-related 2全长cDNA的氨基酸序列，使用ExPasy Protparam软件分析其理化性质。使用InterProScan、Consered Domains、Expasy Prosite软件进行SlMYB-related 2蛋白质结构域及功能位点分析;使用PHDsec program软件进行SlMYB-related 2蛋白的二级结构预测分析，SWISS-MODEL软件进行SlMYB-related 2蛋白的三级结构预测分析。

1.2.2 基因克隆

利用Trizol法提取叶片RNA，然后将其反转录为cDNA。以cDNA为模板扩增SlMYB-related 2基因的全长CDS，PCR扩增反应体系为25 μL：cDNA 1μL，正向引物2 μL，反向引物1 μL，PrimeSTAR Max Premix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。条件为94 ℃预变性5 min，

94 ℃变性30 s，54.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，34个循环。将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收相应的目的片段。

1.2.3 植物过表达载体构建

切胶回收所得DNA和pLB中间载体进行连接并转化到大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，经卡那霉素筛选后挑取阳性克隆进行扩大培养，以pLB-Simple Vector特异引物为引物进行PCR验证。

挑取分别含有pLB-MYB-related 2和pBI121质粒的阳性单菌落进行扩大培养，再分别提取质粒。将pLB-MYB-related 2和pBI121质粒分别进行Xba Ⅰ和Sma Ⅰ双酶切。酶切产物经回收纯化后过夜连接，转化到大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，在含Kan的培养基平板上挑取阳性克隆，扩大培养后提取质粒DNA进行序列测定。

2 结果与分析

2.1 SlMYB-related 2基因生物信息学分析

2.1.1 保守域分析

番茄MYB-related 2基因CDS序列长1 248 bp，编码415个氨基酸。在基因编码的氨基酸序列第44～100位存在典型的MYB转录因子的保守域，myb_SHAQKYF;且在第142～187位存在Myb_CC_LHEQLE转录激活域，均表明SlMYB-related 2符合植物MYB转录因子的基本特征。在第137～292位存在MscS蛋白超家族，表明SlMYB-related 2可能与细胞膜的作用有关。

2.1.2 編码蛋白亲疏水性分析

利用软件ExPasy protscale对SlMYB-related 2编码蛋白进行了亲疏水性分析。结果显示，SlMYB-related 2最大值为1.422，在第82个氨基酸残基处;最小值为?2.667，在第301个氨基酸残基处。

2.1.3 编码蛋白结构与功能域分析

利用PRABI Lyon Gerland软件进行SlMYB-related 2编码蛋白二级结构预测，发现SlMYB-related 2中α-螺旋占34.7%，延伸链占7.47%，无规卷曲占56.14%，β-折叠占1.69%。使用ExPasy Prosite进行功能位点分析。结果显示，SlMYB-related 2功能位点位于41～101位，氨基酸序列为TDAKPRLKWTPDLHERFIEAVTQLGGADkAtPKSVLKLMGIQGLTLYHLKSHLQKYRLSKN。

2.2 基因克隆

以番茄叶片cDNA为模板，对SlMYB-related 2基因进行克隆，经PCR扩增得到目的条带（图1），1%琼脂糖凝胶电泳条带与目的片段长度基本一致。

2.3 植物过表达载体构建

提取pBI121和pLB-SlMYB-related 2质粒，分别用Sma I和Xba I进行双酶切，回收目的片段后用T4 DNA连接酶连接构建pBI-SlMYB-related 2过表达载体。利用PCR进行验证，如图2所示，得到预期大小约为1 258 bp的基因片段，说明该植物过表达载体构建正确。经测序验证，如图3所示，目的基因无突变等错误，可以用于后续实验。

3 结论与讨论

据世界粮农组织的统计数据显示，我国是世界上番茄产量最大的国家，但番茄的不耐低温为番茄产业造成了巨大的经济损失。低温会影响番茄的生长发育，从而进一步影响其外观品质和口感。

本试验克隆得到番茄SlMYB-related 2，全长1 248 bp，

编码415个氨基酸。经生物信息分析学可知，其含有一个转录因子保守域，一个转录激活域且存在MscS蛋白超家族，由此可以推测其亚细胞定位结果，为蛋白质互作位置提供依据方向，从而探究该基因在番茄御冷机制中如何发挥作用。pBI121质粒是一种适用于植物遗传转化的表达载体，是双元T-DNA载体。本试验先将

SlMYB-related 2基因序列构建到pLB中间载体上，再将其与pBI121同时进行双酶切、连接构成植物超表达载体pBI-SlMYB-related 2，经验证其准确无误可以进行后续试验。这一结果表明，本试验构建的pBI-SlMYB-related 2过表达载体在进行植物基因表达和功能研究中具有一定的使用价值。

参考文献：

[1] Takos，AM，Jaffé FW，Jacob SR，et a1.Light-induced expression of a MYB gene regulates anthocyanin biosynthesis in red apples[J].Plant Physiol，2006，142（3）：1216-1232.

[2] Kobayashi S，Goto-Yamamoto N，Hirochika H.Retrotrans-

poson-induced mutations in grape skin color[J].Science，

2004，304（5673）：982-988.

[3] Walker AR，Lee E，Bogs J，et a1.White grapes arose through the mutation of two similar and adjacent regulatory genes[J].The Plant Journal，2007，49（5）：772-785.

（责任编辑：赵中正）